細菌生物膜的結構及形成機制的研究進展

祝司霞

（攀枝花學院醫學院形態學教研室，四川攀枝花 617000）

細菌生物膜的結構及形成機制的研究進展

祝司霞

（攀枝花學院醫學院形態學教研室，四川攀枝花 617000）

生物膜；結構；形成機制

難以被擺脫和清除，而且對抗生素的抵抗力比浮游細菌增強很多倍，所以BF感染性疾病非常頑固，經常導致慢性化，難以治愈。對BF的基本結構及形成機制的探討是研究BF的最基本的環節，

可以為更深入地揭示BF的耐藥性、抵抗性以及如何預防BF的形成，更好地清除、消滅BF，徹底治愈疾病提供理論依據。

1 BF的定義及特點

1.1 BF的定義 自然界中，99.9%的細菌以BF形式存在，細菌BF是細菌及其分泌的胞外多糖等物質所形成的膜狀細菌群體，對環境的適應能力極強，是細菌抵抗外界惡劣環境的一種自我保護形式，與浮游細菌不同，它是微生物群體的聚集，細菌之間借信號分子相互交流［2］。

1.2 BF的特點

1.2.1 耐藥性極強 研究表明，成熟BF內細菌耐藥性比浮游細菌高500～5 000倍［3］，這是由于BF具有屏障作用，防止抗生素的滲入，BF中的細菌生長速度較慢，對抗生素不敏感，有的細菌能分泌抗生素分解酶，產生抗生素外排泵，甚至基因表達改變，導致細菌產生強大的耐藥性。耐藥性是臨床感染遷延不愈，病原菌難以徹底清除的重要原因［4-5］，近年來，抗生素雖然廣泛應用，但仍然無法控制細菌的感染，尤其是在小兒、老年人、長期患病、免疫力低下的患者，或重癥監護病房中，BF引起的感染更為棘手，所以目前抑制BF藥物的研究受到廣泛重視。

1.2.2 抗吞噬性極強 對于BF細菌，由于包裹著細菌的黏性基質將細菌和機體免疫系統隔開，BF細菌可抵抗吞噬細胞的吞噬，逃避宿主免疫系統的攻擊，使感染慢性化并難以控制［6］。研究顯示，藻酸鹽的過度表達可創造水合微環境，促使黏液型銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）BF的形成，可保護PABF內的細菌免受γ-干擾素介導的巨噬細胞攻擊，具有免疫抑制作用［7］。所以干擾BF形成過程中藻酸鹽等關鍵基因的表達，有可能降低BF細菌的抗吞噬能力。

1.2.3 黏附性極強 BF可以通過各種復雜的機制牢固地黏附在宿主細胞或植入人體的醫用器械表面，要想用常規的清洗措施清除BF基本無效，從而造成醫院的交叉感染。近年來，隨著各類移植性生物材料（如人工瓣膜、血管支架、靜脈導管及關節假體等）在臨床上應用的日益增多，附著在移植物表面的細菌BF感染也日益增多。因此，如何防止細菌形成BF及徹底清除BF，逐漸成為醫院感染控制的目標和研究熱點。

目前去除BF可以用蛋白酶和纖維素酶等多種酶共同作用的方法，酶能降解信號分子或破壞BF的群體感應系統；此外，Davies等［8］觀察到綠膿桿菌能產生一種叫順-2-癸烯酸的生物表面活性劑，它能使成熟的大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等的BF結構疏松，易于去除；徐卓佳等［9］研究表明，裂解性噬菌體ΦS1可以將熒光假單胞菌85%的BF去除，將幾種噬菌體聯用效果可能更好，這種方法具有天然、無毒、特異性強的優點；此外，滴流式反應器可用于血流感染BF的去除，膜式反應器可用于篩選不同表面活性劑對BF的去除效果。

2 BF的結構

細菌BF是有三維結構的菌細胞群體，其中少部分是細菌，大部分是細菌分泌的胞外聚合物，包括胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）和蛋白質等，EPS等構成結構精細的網絡或框架，支持菌體細胞、菌體互相黏連附著在框架表面。Flem-ming等［10］認為，細菌BF結構類似于人類居住的社區，其中房屋是胞外聚合物，細菌是居民，住在房屋中，這種結構堅實穩定，不易被破壞，使細菌的存活能力顯著提高。Moscoso等［11］用低溫掃描電子顯微鏡觀察肺炎鏈球菌BF，發現有小而薄的細絲連接細菌，細菌團簇之間有水通道孔，類似蜂巢的結構。

Lenz等［12］認為BF的結構具有不均質性，分表層菌和里層菌，不同層面的細菌理化特性差異顯著，表層菌代謝活躍，分裂較快；里層菌則反之。由于細菌所處微環境不同，所以導致相同的細菌其基因表達模式不同，因此，不同細菌或同一細菌所處環境不同所形成的BF存在結構差異，或疏松，或致密，厚薄不均。但目前為止盡管人們對BF的結構開展了很多研究，仍不十分清楚。

3 BF的形成

3.1 形成過程 BF的形成受到環境因素的影響，主要受營養成分的影響，此外與細菌所處的溫度、pH、水流沖刷力、介質表面特性、滲透壓和氧化還原電位等有關。在合適的條件下，任何細菌均能形成BF。形成BF的能力因細菌而異，有的形成速度快，有的速度慢。BF的形成主要經歷黏附、發展、成熟和播散等過程，在不同的階段，BF的化學物質的組成比例、結構、形態、對抗生素的敏感性和清除的難易度等差別很大。

3.1.1 菌體黏附 此期細菌黏附到宿主表面，菌體互相聚集，形成一層薄膜。尤其是在組織病變或體內有植入的生物材料時，一些含有多糖、蛋白質或無機物質的體液，如尿液、血液、胃腸道液、唾液等就會很快覆蓋到這些病變組織或生物材料表面，形成一個2～10 nm的具有吸附能力的調節膜［13］，細菌會特異性黏附到調節膜表面的蛋白或多糖受體上。黏附是BF形成的關鍵步驟，黏附后的細菌不容易被流體沖走，如尿道中的大腸桿菌BF黏附牢固，不容易被尿液沖走。（1）非特異性黏附：細菌在物體表面定植的起始步驟，通常包括細菌向物體表面的移動和微黏度的改變，而微黏度的改變會引起細菌在靠近表面時移動性下降，這時細菌在靜電引力和范德華力的作用下，會短暫、可逆地趨向表面［14］。此外，菌體表面的附屬結構及黏附因子也有助于菌體的黏附聚集，鞭毛的運動使細菌克服與宿主表面的斥力相互接觸，普通菌毛促使菌體的黏附。細菌在與物體表面的接觸過程中，經歷了細胞形態和鞭毛合成的巨大變化，這牽扯到基因表達調控的巨大變化，細菌一旦黏附，其鞭毛合成可能被完全抑制。此期在BF的形成過程中最弱。（2）特異性黏附：主要是細菌與宿主表面進行受體和配體間的特異性和選擇性的結合，宿主表面提供蛋白、糖蛋白和糖脂等受體，細菌借助特定蛋白黏附其上。張曉雷等［15］通過構建尿路致病性大腸桿菌（uropathogenic escherichia coli，UPEC）黏附素基因iha敲除缺陷株，分析iha基因缺失對UPECBF形成的影響，結果表明基因缺陷菌株與野生菌株相比BF形成能力降低（P＜0.01），提示iha基因及其編碼產物參與UPECBF的形成，通過抑制該基因的表達有望為控制尿路感染提供新的靶點。李芳等［16］則認為細菌在黏附過程中，主要產生EPS藻酸鹽，能連接細胞，使BF增厚，所以可以通過影響藻酸鹽合成過程中重要基因的表達，降低藻酸鹽合成限速酶GMD的活性等，來達到抑制BF形成的目的。此階段尚未形成成熟的BF，細菌抗力不強，容易去除，選擇此時用藥治療感染性疾病，效果相對較好。

3.1.2 BF的發展 初步形成BF后，游動菌體不斷黏附其上，已附著的細菌大量繁殖，眾多菌體分泌大量EPS，將細胞凝結成團塊狀，即微菌落。不同細菌或同一細菌的不同菌株微菌落的形成能力不同，葉聯華等［17］在探討ica操縱子在聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料表面表皮葡萄球菌BF形成中的作用時發現，表皮葡萄球菌ica操縱子陽性菌株可以增加PVC材料表面BF的形成能力、細菌群落數量及BF厚度。

此期BF不斷加厚，具有剛性與柔韌性，細菌對不良環境的抵抗力更強，對抗生素的敏感性降低，導致難治性感染的發生。

3.1.3 BF的成熟 即微菌落進一步連接、擴大的過程，大量微菌落使細菌BF加厚并逐漸成熟。微菌落類似蘑菇狀，微菌落之間有相互連接的運送代謝產物、營養和廢物的通道，此時，BF是一個高度有組織的特殊功能性結構群落。

3.1.4 細菌播散 BF成熟后，有些細菌能自我分離或受到外界作用力而從BF中脫落成為游離菌［14］，游離菌可以進入血液引起菌血癥，或播散到它處尋找新的宿主表面并黏附，從而開始新的BF形成周期，導致疾病惡性循環。

3.2 形成的調控機制 在BF的形成過程中存在信號轉導調控機制，目前學術界比較公認的是細菌群體感應（quorum sensing，QS）系統。QS是指細菌根據群體密度的大小利用信號分子進行信息交流，并調控特定基因的表達使群體行為協調。細菌合成并分泌的一些特定信號分子也稱為信息激素或自身誘導素（autoinducer，AI），AI主要包括作用于革蘭氏陰性菌的N-酰基高絲氨酸內酯類（acylhom oserine lactones，AHLs）、作用于革蘭氏陽性菌的寡肽類分子AIP（autoinducing peptide）以及革蘭氏陰性和陽性細菌間的種間通用信號分子AI-2（autoinducer-2）等［18-19］。QS系統能幫助細菌黏附，進而分泌大量的EPS等物質，以形成穩定的BF，還能使菌體感受自身密度的變化，隨著細菌密度的增加信號分子也增加，當細菌密度達到一定閾值時，信號分子與細胞膜或細胞質中的受體結合，某些基因被激活并表達，然后發出信號并協調群體行為，避免因細菌過度生長而造成空間和營養物質的缺乏，QS系統使細菌具有社會化特征［20］。因此，抑制群體感應系統可以防止細菌黏附或使EPS等物質的分泌減少，從而干擾BF的形成，成為控制感染的新方向。

綜上所述，細菌BF與浮游細菌相比有許多不同的特性，給臨床治療帶來很大的麻煩。近年來，隨著相關學科的發展及研究技術的進步，BF的研究已經取得了較大進展，許多問題被解決，但同時有關細菌BF的很多謎團仍未破解，今后的研究重點應放在BF形成的遺傳物質基礎和基因調控機制上，從基因組水平和蛋白組水平來構建BF形成模型，利用基因敲除等分子技術，揭示BF形成不同階段的分子機理，進一步闡明BF與機體免疫關系、BF耐藥機制等問題，并為預防、控制和去除BF建立有效的策略，從而減少BF感染性疾病的發生。

［1］ 唐俊妮，史賢明，王紅寧.細菌生物膜的形成與調控機制［J］.生物學雜志，2009，26（2）：48-50.

［2］ 朱元元，徐峰.留置導管內細菌生物膜感染的研究進展［J］.中華醫院感染學雜志，2007，17（1）：115-117.

［3］ 何年安，王文平.超聲在細菌生物膜相關感染治療中的應用［J］.中華超聲影像學雜志，2012，21（9）：815-817.

［4］ Mukherjee PK，Mohamed S，Chandra J，et al.Alcohol dehydrogenase restricts the ability of the pathogen Candida albicans to form a biofilm on catheter sur-faces through an ethanol-based mechanism［J］.Infect Immun，2006，74（7）：3804-3816.

［5］ 陳鐵柱，李曉聲，曾文魁.細菌生物膜耐藥機制的研究與進展［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（12）：2205-2207.

［6］ 王龍梓，王貴年.銅綠假單胞菌生物膜抑制藥研究進展［J］.中國感染控制雜志，20l1，10（1）：74-75.

［7］ Hay ID，Garland K，Campisano A，et al.Impact of alginate Overproduction on at-tachment and biofilm architecture of a supermucoid Pseudomonas aeruginosa strain［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75（18）：6022-6025.

［8］ Davies DG，Marques CN.A fatty acid is responsible for inducing dispersion in microbial biofilms［J］.J Bacteriology，2009，191（12）：1393.

［9］ 徐卓佳，王棟棟，王鎧.雙級反滲熱消毒透析水處理系統表面細菌生物膜形成的研究［J］.中華腎臟病雜志，2013，29（1）：57-58.

［10］ Flemming HC，Neu TR，Wozniak DJ.The EPS matrix：the“house of biofilm cells”［J］.J Bacteriology，2007，189（22）：7945-7947.

［11］ Moscoso M，García E，López R.Biofilm formation by Streptococcus pneumoniae：role of choline，extracellular DNA，and capsular polys-accharide in microbial accretion［J］.J Bacteriol，2006，188（22）：7785-7795.

［12］ Lenz AP，Williamson KS，Pitts B，et al.Localized gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（14）：4463-447l.

［13］ 陳靜，劉顯軍，邊連全，等.細菌生物膜及細菌群體感應系統的研究進展［J］.江蘇農業學，2010，（5）：32-33.

［14］ 胡金樹，趙建宏.細菌生物膜的形成及影響因素［J］.中華醫院感染學雜志，2009，19（18）：2519-2520.

［15］ 張曉雷，毛立群，葛新，等.尿路致病性大腸桿菌iha基因敲除及其對細菌生物膜形成的影響［J］.第二軍醫大學學報，2013，34（6）：671-675.

［16］ 李芳，余加林，鄧兵.氨溴索對黏液型銅綠假單胞菌生物膜藻酸鹽作用的體外研究［J］.中國微生態學雜志，2008，20（5）：433-437.

［17］ 葉聯華，黃云超，楊達寬，等.聚氯乙烯材料表面細菌生物膜結構觀察［J］.生物醫學工程與臨床，2007，11（4）：251-256.

［18］ Camilli A，Bassler BL.Bacterial small-molecule signaling pathways［J］.Science，2006，311（5764）：1113-1116.

［19］ 鄭甜甜，黃丹，班允赫，等.群體感應抑制控制膜生物污染的研究進展［J］.遼寧化工，2013，42（10）：1181-1185.

［20］ Nakamura S，Higashiyama Y，Izumikawa K，et a1.The roles of the quorum-sensing system in the release of extracellular DNA，lipopolysaccharide，and membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa［J］.Jpn J Infect Dis，2008，61（5）：375-378.

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1008-2344（2015）02-0115-03 doi：10.3969/j.issn.1008-2344.2015.01.020根據美國NIH統計，超過80%的人類感染性疾病是由細菌生物膜（biofilm，BF）介導的［1］。BF的黏附能力極強，可以黏附在人體和各種醫用材料上（如人工關節、人工瓣膜、各種導管等），

2014-11-10