自限性和慢性HBV感染患者IFN-ω1、IFNGR基因的單核苷酸多態(tài)性觀察

王亞莉，賴(lài)翼，劉陽(yáng)，胡章勇，楊軍，鄧蘭(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，成都610500)

自限性和慢性HBV感染患者IFN-ω1、IFNGR基因的單核苷酸多態(tài)性觀察

王亞莉，賴(lài)翼，劉陽(yáng)，胡章勇，楊軍，鄧蘭
(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，成都610500)

摘要:目的觀察自限性和慢性乙型肝炎病毒( HBV)感染患者干擾素ω1( IFN-ω1)、干擾素γ受體( IFNGR)基因的單核苷酸多態(tài)性( SNP)。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法檢測(cè)206例自限性HBV感染者(對(duì)照組)和210例慢性HBV感染者(病例組) IFN-ω1基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)、IFNGR基因上4個(gè)位點(diǎn)，比較兩組基因型和等位基因頻率。結(jié)果病例組、對(duì)照組IFNGR基因的rs9376267位點(diǎn)CT基因型頻率分別為48.4%、60.3%，兩組比較，P =0.012。兩組IFN-ω1、IFNGR基因其他SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論自限性HBV感染患者IFNGR基因上的rs9376267位點(diǎn)CT基因型頻率較慢性HBV感染患者高。

關(guān)鍵詞:干擾素ω1;干擾素γ受體;乙型肝炎病毒感染;基因單核苷酸多態(tài)性

Observation of gene single nucleotide polymorphisms of IFN-ω1 and IFNGR in self-limiting HBV infection and chronic HBV infection patients

WANG Ya-li，LAI Yi，LIU Yang，HU Zhang-yong，YANG Jun，DENG Lan
( The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China)

Abstract:Objective To observe the gene single nucleotide polymorphisms ( SNPs) of interferon-ω1 ( IFN-ω1) and interferon-γ receptor ( IFNGR) in self-limiting hepatitis B virus ( HBV) infection and chronic HBV infection patients.Methods PCR-RFLP was used to detect four SNP sites of IFN-ω1 and four sites of IFNGR in 206 cases of patients with self-limiting HBV infection ( control group) and 210 cases of patients with chronic HBV infection ( case group).The genotype and allele frequency of the two groups were compared.Results The rs9376267 gene loci CT genotype frequencies of IFNGR in the case group and control group were respectively 48.4% and 60.3% ( P =0.012).No statistically significant difference was found between the two groups in the genotype and allele frequency of other SNP sites of IFN-ω1 and IFNGR genes.Conclusion The CT genotype frequency on IFNGR rs9376267 site in patients with self-limiting HBV infection was higher than that of the patients with chronic HBV infection.

Key words:interferon-ω1; interferon-γ receptor; hepatitis B virus infection;gene single nucleotide polymorphism

乙型肝炎病毒( HBV)感染是目前世界上最主要的感染性疾病之一，人感染HBV可分為自限性HBV感染和慢性HBV感染。在相同的環(huán)境和膳食因素影響下，部分人會(huì)表現(xiàn)出對(duì)慢性HBV感染的易感性。HBV感染人體后表現(xiàn)出不同的臨床類(lèi)型，與宿主基因的易感性、免疫細(xì)胞、免疫因子、病毒的基因型(亞型)、變異特征和環(huán)境因素等有關(guān)。干擾素( INF)具有抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化等作用，在HBV感染者免疫細(xì)胞因子中占據(jù)重要地位。因此，我們通過(guò)查單核苷酸多態(tài)性( SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選了IFN-ω1、IFN-γ受體( IFNGR)基因上SNP位點(diǎn)( rs1895673、rs10757189、rs10511694、rs10964859、rs9376267、rs1327475、rs7749390、rs3799488)。本研究觀察了自限性和慢性HBV感染患者IFN-ω1、IFNGR基因的SNP，為協(xié)助疾病預(yù)測(cè)分析和指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2010年12月～2013年12月

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院或門(mén)診就診的HBV感染患者。根據(jù)2010年12月頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)，分為慢性HBV感染者(病例組)、自限性HBV感染者(對(duì)照組)。病例組為凡是乙肝五項(xiàng)檢查提示HBsAg +的患者，包括無(wú)癥狀HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、乙肝相關(guān)性肝癌，排除存在其他慢性肝病的致病因素(非HBV病毒感染、自身免疫性肝炎、脂肪肝等)者。對(duì)照組患者為凡是未經(jīng)過(guò)治療，乙肝五項(xiàng)檢查結(jié)果為HBsAg－、HBsAb +、HBeAg－、HBeAb +、HBcAb +或HBsAg－、HBsAb +、HBeAg－、HBeAb +、HBcAb－或HBsAg－、HBsAb +、HBeAg－、HBeAb－、HBcAb +者。

1.2 IFN-ω1、IFNGR基因SNP基因型和等位基因頻率檢測(cè)由上海天昊遺傳分析中心設(shè)計(jì)和合成8對(duì)引物。rs9376267上游引物為5'-GGCTACAATGAGGATGGCCAATTT-3'，下游引物為5'-AGCCCTGCACACCCCAGAG-3'; rs1327475上游引物為5'-TGCTTCCAACATCTTTGTGATCGT-3'，下游引物為5'-TGTTCAACTTTTGCAGTGGCCATA-3'; rs7749390上游引物為5'-GAAAGGCAACCGACGAGTTCAA-3'，下游引物為5'-TTTCTCCTACCCCTTGTCATGCAG-3'; rs3799488上游引物為5'-TTGCTGGAGACAACGGCTCTTC-3'，下游引物為5'-TGTGCCATTTGGTGGTCCATTAC-3'; rs1895673上游引物為5'-CCACATTCTTCTCTAGATGCCACCTT-3'，下游引物為5'-GTGAGGGCTGAGCTGTCCTACTG-3'; rs10964859上游引物為5'-CCGTCCATTCCTTGATTTGGTTC-3'，下游引物為5'-GGTTCAGGGGCATCAGTCCCTA-3'; rs1075 7189上游引物為5'-TGCTGTTTTATTCACAACAGAGGATGA-3'，下游引物為5'-TGTGAGGAGACGCTGGGAAA-3'; rs10511694上游引物為5'-TCCCAGGGAGCAGTCTCACAAC-3'，下游引物為5'-ATGGGTCAGGAGGAAAGGAGGT-3'。留取研究對(duì)象的外周血標(biāo)本，提取基因組DNA，取EDTA抗凝靜脈血2 mL，分裝，－20℃凍存，采用大連寶生物公司提供基因組提取試劑盒提取基因組DNA，－20℃分裝凍存，詳細(xì)記錄每名入選者的臨床資料。PCR1反應(yīng)體系( 20 μL)包含1×緩沖液(大連寶生物工程有限公司)、3.0 mmol/L Mg2 +、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq聚合酶( Qiagen公司)、1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR2反應(yīng)體系( 10 μL)包含1×GC緩沖液(大連寶生物工程有限公司)、3.0 mmol/L Mg2 +、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq聚合酶( Qiagen公司)、1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。SNP位點(diǎn)中5個(gè)適用于PCR1反應(yīng)體系，rs1327475的上下游引物濃度均為2 μmol/L，rs1895673、rs3799488、rs9376267、rs10757189的上下游引物濃度均為1 μmol/L;3個(gè)適用于PCR2反應(yīng)體系，其中rs10964859、rs7749390的上下游引物濃度均為2 μmol/L，rs10511694的上下游引物濃度均為1 μmol/L。PCR循環(huán)程序?yàn)?5℃2 min，11個(gè)循環(huán)( 94℃20 s，65℃依次遞減0.5℃循環(huán)40 s，72℃1 min 30 s)，24個(gè)循環(huán)( 94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min)，72℃2 min，4℃。在10 μL PCR產(chǎn)物中加入1 U SAP酶和1 U ExonucleaseⅠ酶，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。rs7749390SR延伸引物為5'-CCGTCCTCAGGTACCGTCG-3'，rs10511694SF延伸引物為5'-TTTTTTTTGGACCCTGGCTCTCAGTGG-3'，rs10757189SR延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACCTTGTGGTCCCAGTGAAG-3'，rs10964859 SR延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACATGTTCAGCTTTCSATTTG-3'，rs1327475SR延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAAACATTACCTGAAGCAGATG-3'，rs1895673SF延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTctTATTTCCTTTTTCCACTTGACAAAC-3'，rs3799488SF延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAGTAGCACTTCTTACCACAGASATCTA-3'，rs9376267SF延伸引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACACATTCCAGTTTCATCAACA-3'。延伸反應(yīng)體系( 10 μL)包括5 μL SNaPshot Multiplex Kit ( ABI)、2 μL純化后多重PCR產(chǎn)物、1 μL延伸引物混合物、2 μL超純水。rs1895673SF、rs3799488SF、rs9376267SF、rs10757189SR、rs10511694SF引物濃度均為0.8 μmol/L，rs1327475SR、rs7749390SR引物濃度均為1.6 μmol/L，rs10964859SR引物濃度為2.4 μmol/L。PCR循環(huán)程序?yàn)?6℃1 min，28個(gè)循環(huán)( 96℃、10 s，50℃、5 s，60℃、30 s)，4℃。在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL LIZ120 Size Szandard、9 μL Hi-Di混勻，95℃變性5 min后上ABI3130XL測(cè)序儀，用GeneMapper 4.0 ( Applied Biosystems Co.Ltd.，USA)分析原始數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

病例組210例，其中男126例、女84例，年齡

( 44.6±13.8)歲;對(duì)照組206例，其中男103例、女103例，年齡( 44.6±14.8)歲。兩組年齡比較，t = －0.002，P = 0.998。兩組性別分布比較，χ2= 4.202，P =0.04。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)部分雜合子位點(diǎn)偏離正常分布，原因可能為樣本有效濃度極低或嚴(yán)重污染，分型數(shù)據(jù)可靠性低，故刪除，數(shù)據(jù)分析時(shí)對(duì)照組189例、病例組192例。病例組、對(duì)照組rs1895673位點(diǎn)AA基因型頻率分別為59.9%、64.0%，AG基因型頻率分別為37.5%、29.6%，GG基因型頻率分別為2.6%、6.3%; rs10757189位點(diǎn)GG基因型頻率分別為36.5%、36.5%，GA基因型頻率分別為49.5%、46.6%，AA基因型頻率分別為14.1%、16.9%; rs10511694位點(diǎn)CC基因型頻率分別為28.6%、28.6%，CT基因型頻率分別為53.6%、49.2%，TT基因型頻率分別為17.7%、22.2%; rs10964859位點(diǎn)CC基因型頻率分別為71.4%、71.4%，CG基因型頻率分別為26.0%、27.0%，GG基因型頻率分別為2.6%、1.6%; rs9376267位點(diǎn)CC基因型頻率分別為31.8%、22.2%，CT基因型頻率分別為48.4%、60.3%，TT基因型頻率分別為19.8%、17.5%; rs1327475位點(diǎn)GG基因型頻率分別為78.6%、79.9%，GA基因型頻率分別為19.8%、19.6%，AA基因型頻率分別為1.6%、5.0%; rs7749390位點(diǎn)GG基因型頻率分別為33.3%、31.2%，GA基因型頻率分別為49.0%、55.6%，AA基因型頻率分別為17.7%、13.2%; rs3799488位點(diǎn)TT基因型頻率分別為54.7%、52.9%，TC基因型頻率分別為39.6%、41.8%，CC基因型頻率分別為5.7%、5.3%。兩組rs9376267位點(diǎn)CT基因型的頻率比較，P =0.012。兩組其他SNP位點(diǎn)基因型頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

病例組、對(duì)照組rs1895673位點(diǎn)等位基因A分布頻率分別為78.5%、78.8%，等位基因G分布頻率分別為21.4%、21.2%; rs10757189位點(diǎn)等位基因G分布頻率分別為61.2%、59.8%，等位基因A分布頻率分別為38.8%、40.2%; rs10511694位點(diǎn)等位基因C分布頻率分別為55.5%、53.2%，等位基因T分布頻率分別為44.5%、46.8%; rs10964859位點(diǎn)等位基因C分布頻率分別為84.4%、84.9%，等位基因G分布頻率分別為15.6%、15.1%; rs9376267位點(diǎn)等位基因C分布頻率分別為56.0%、52.4%，等位基因T分布頻率分別為44.0%、47.6%; rs1327475位點(diǎn)等位基因G分布頻率分別為88.5%、89.7%，等位基因A分布頻率分別為11.5%、10.3%; rs7749390位點(diǎn)等位基因G分布頻率分別為57.8%、59.0%，等位基因A分布頻率分別為42.2%、41.0%; rs3799488位點(diǎn)等位基因T分布頻率分別為74.5%、73.8%，等位基因C分布頻率分別為25.5%、26.2%。兩組上述SNP位點(diǎn)的等位基因分布頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3　討論

HBV感染機(jī)制尚不清楚，除與HBV病毒本身(病毒含量、病毒變異、病毒基因型等)、環(huán)境因素有關(guān)外，還與宿主機(jī)體的免疫狀況等有關(guān)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)宿主抗HBV的基因的多態(tài)性，在HBV感染后不同的臨床轉(zhuǎn)歸及其易感性方面也發(fā)揮著重要作用。機(jī)體清除HBV需要先天性和后天性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的共同參與，細(xì)胞因子在這個(gè)過(guò)程中起著非常重要的作用［1］。在清除HBV的過(guò)程中，機(jī)體的免疫功能，尤其是特異性細(xì)胞免疫功能發(fā)揮著重要的作用，它啟動(dòng)機(jī)體釋放大量免疫細(xì)胞因子清除HBV。IFN是細(xì)胞和機(jī)體受到病毒感染，或者受核酸、細(xì)菌內(nèi)毒素和促細(xì)胞分裂素等作用后，由受體細(xì)胞分泌的一種廣譜抗病毒糖蛋白。IFN是多功能蛋白，可以直接作用或者通過(guò)誘導(dǎo)、活化其他蛋白，調(diào)節(jié)多種反應(yīng)。根據(jù)免疫原性和分子結(jié)構(gòu)的不同，可將INF分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、IFN-κ各型，每型還存在多種結(jié)構(gòu)序列不同的亞型。其中IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-κ具有抗酸性作用，合稱(chēng)為Ⅰ型IFN。IFN-γ對(duì)酸性敏感，稱(chēng)為Ⅱ型IFN或免疫IFN，主要參與誘導(dǎo)主要組織相容性抗原( MHC)的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)［2］。IFN通過(guò)與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)靶細(xì)胞合成抗病毒蛋白( AVP)，如蛋白激酶( PKR)、磷酸二脂酶、2-5腺苷酸合成酶、RNase L、MxA蛋白等。這些AVP能破壞細(xì)胞核糖體轉(zhuǎn)譯病毒蛋白質(zhì)、降解病毒mRNA;有的抑制轉(zhuǎn)錄酶，阻止病毒mRNA的形成;還有的能抑制病毒DNA和RNA的合成，達(dá)到抗病毒作用。IFN能提高巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、毒性T淋巴細(xì)胞( CTL) 和B淋巴細(xì)胞的殺傷水平而增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和TNF-α、TRAIL的產(chǎn)生及分泌，共同促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，故在眾多免疫細(xì)胞因子中占據(jù)了重要地位，其SNP影響著HBV感染者的轉(zhuǎn)歸。

細(xì)胞因子的表達(dá)量受基因調(diào)控，位于基因表達(dá)調(diào)控區(qū)序列的SNP影響基因的表達(dá)量，在疾病的個(gè)體差異方面有重要意義。IFN-γ特異結(jié)合IFNGR，細(xì)胞表面的這些受體具有數(shù)量少、親和力高和種族持異性的特點(diǎn)，能促進(jìn)IFN-γ分泌。目前許多學(xué)者對(duì)IFN-γ基因上部分SNP位點(diǎn)與HBV感染相關(guān)性

的研究較多，但對(duì)于IFNGR及IFN-ω與HBV感染的相關(guān)性研究尚不多。Zhou等［3］研究了IFNGR多個(gè)SNP位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在IFNGR啟動(dòng)子上的－56C/T SNP與HBV感染結(jié)局有關(guān)。Cheong等［4］研究了IFN-γ、IFNGR及IFN調(diào)控因子1上的部分位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)與HBV易感性無(wú)明顯相關(guān)。Oliver等［5］報(bào)道了IFNGR啟動(dòng)子的多態(tài)性在不同的細(xì)胞環(huán)境中有相反的效應(yīng)。通過(guò)篩查SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，目前已證實(shí)的中國(guó)人群IFNGR基因上的SNP位點(diǎn)有11個(gè)，在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控及外顯子區(qū)域中，次要等位基因頻率( MAF)大于0.1的SNP位點(diǎn)共4個(gè)，IFNGR的表達(dá)水平可能與這些SNP位點(diǎn)相關(guān)，影響IFN-γ的表達(dá)水平，目前尚無(wú)對(duì)上述SNP位點(diǎn)與HBV感染相關(guān)性的研究。此外，有研究證明IFN-ω基因中有多個(gè)家族成員，主要是IFN-ω1有功能，其具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)的作用。Flores等［6］研究證實(shí)IFN-ω可影響IFN-α、IFN-β的表達(dá)水平。還有研究［7，8］表明，從牛的基因組DNA提取出的IFN-ω即使跨種屬也具有較高的抗病毒活性，它在體外抗乙肝病毒的活性與IFN-α相當(dāng)，IFN-ω不僅在體外能夠抑制慢性髓性白血病患者骨髓祖細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且能夠上調(diào)乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系表面MHCⅠ類(lèi)分子的表達(dá)，這些結(jié)果表明IFN-ω在體外有抗腫瘤、抗增殖和免疫調(diào)控效應(yīng)［9］。IFN-ω1基因上的SNP位點(diǎn)與HBV感染的關(guān)系較少有研究報(bào)道，通過(guò)SNP數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)中國(guó)人群IFN-ω1基因上的SNP位點(diǎn)有7個(gè)，在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控及外顯子區(qū)域中，MAF大于0.1 的SNP位點(diǎn)有4個(gè)，IFN-ω1的表達(dá)水平可能與這些SNP位點(diǎn)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，自限性HBV感染患者IFNGR基因上的rs9376267位點(diǎn)CT基因型頻率較慢性HBV感染患者高。這些均提示攜帶IFNGR的rs9376267CT基因型的人群不是慢性HBV感染的易感基因型，這類(lèi)人群乙肝慢性化的發(fā)生率低。

參考文獻(xiàn):

［1］鄒曉毅，姚云清.機(jī)體清除乙型肝炎病毒免疫機(jī)制研究新進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):病毒學(xué)分冊(cè)，2005，12( 2) : 42-45.

［2］武迎紅，王學(xué)理，段小宇，等.干擾素的研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，22( 4) : 425-428.

［3］Zhou J，Chen DQ，Poon VK，et al.A regulatory polymorphism in interferon-gamma receptor 1 promoter is associated with the susceptibility to chronic hepatitis B virus infection［J］.Immunogenetics，2009，61( 6) : 423-430.

［4］Cheong JY，Cho SW，Chung SG，et al.Genetic polymorphism of interferon-gamma，interferon-gamma receptor，and interferon regulatory factor-1 genes in patients with hepatitis B virus infection［J］.Biochem Genet，2006，44( 5-6) : 246-255.

［5］Oliver K，Dominic P.Kwiatkowski，et al.Context-specific functional effects of IFNGR1 promoter polymorphism［J］.Hum Mol Genet，2006，15( 9) : 1475-1481.

［6］Flores I，Mariano TM，Pestka S.Human interferon omega ( omega) binds to the alpha/beta receptor［J］.J Biol Chem，1991，266 ( 30) : 19875-19877.

［7］Rodríguez M，Martínez V，Alazo K，et al.The bovine IFN-omega 1 is biologically active and secreted at high levels in the yeast Pichia pastoris［J］.J Biotechnol，1998，60( 1-2) : 3-14.

［8］Hagelstein J，Kist A，Stremmel W，et al.Antiviral potential of interferon-omega on hepatitis B virus replication in human hepatoma cells［J］.Arzneimittelforschung，1998，48( 3) : 343-347.

［9］馬麗麗，楊吉成.新的干擾素的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):微生物學(xué)分冊(cè)，2005，28( 1) : 15-17.

收稿日期:( 2015-04-21)

作者簡(jiǎn)介:第一王亞莉( 1980-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)椴《拘愿窝椎脑\斷與治療。E-mail: 447243359@ qq.com

基金項(xiàng)目:四川省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目( 100098)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 31-0001-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R512.6

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.001