擴(kuò)張型心肌病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-155表達(dá)及意義

顏小飛，黃糧，嚴(yán)蓮花，胡芬，王亞，馬聞晗，盧帥，，汪朝暉( 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢4300;武漢市第四醫(yī)院)

擴(kuò)張型心肌病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-155表達(dá)及意義

顏小飛1，黃糧2，嚴(yán)蓮花1，胡芬1，王亞1，馬聞晗1，盧帥1，2，汪朝暉1
( 1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢430022;2武漢市第四醫(yī)院)

摘要:目的探討微小RNA-155( miR-155)在擴(kuò)張型心肌病( DCM)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞( PBMC)中的表達(dá)變化及其與心功能的關(guān)系。方法選擇DCM患者(觀察組)及同期健康志愿者(對(duì)照組)各30例，觀察組NYHA心功能Ⅱ級(jí)10例、Ⅲ級(jí)11例、Ⅳ級(jí)9例。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離兩組空腹靜脈血中的PBMC，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PBMC中miR-155的相對(duì)表達(dá)量。比較觀察組不同NYHA心功能分級(jí)者PBMC中miR-155的相對(duì)表達(dá)量，并分析其相關(guān)性。觀察組同時(shí)行彩色多普勒檢查，記錄其左心室射血分?jǐn)?shù)( LVEF)、左心室舒張末期內(nèi)徑( LVEDd)，分析兩者與miR-155表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果觀察組miR-155相對(duì)表達(dá)量為0.50±0.24，對(duì)照組為1.00±0.23;兩組比較，P＜0.01。觀察組NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)者miR-155相對(duì)表達(dá)量分別為0.77±0.10、0.47±0.10、0.23±0.08，多組間及組內(nèi)兩兩比較，P均＜0.01。觀察組LVEF為28%±10%，LVEDd為( 70±7) mm。觀察組miR-155相對(duì)表達(dá)量與NYHA心功能分級(jí)、LVEF、LVEDd均呈負(fù)相關(guān)( r分別為－0.94、－0.67、－0.53，P＜0.05或＜0.01)。結(jié)論DCM患者PBMC中miR-155表達(dá)降低，與患者心功能受損的嚴(yán)重程度有關(guān)。

關(guān)鍵詞:擴(kuò)張型心肌病;微小RNA-155;外周血單個(gè)核細(xì)胞;心功能

Expression changes and significance of miR-155 in peripheral blood mononuclear cells of patients with dilated cardiomyopathy

YAN Xiao-fei1，HUANG Liang，YAN Lian-hua，HU Fen，WANG Ya，MA Wen-han，LU Shuai，WHANG Zhao-hui
( 1 Union Hospital，Tongji Medicial College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China)

Abstract:Objective To observe the expression changes of microRNA-155 ( miR-155) in the peripheral blood mononuclear cells ( PBMC) of patients with dilated cardiomyopathy ( DCM) and to explore the relationship between miR-155 level and heart function.Methods Thirty patients with DCM ( observation group) and 30 healthy volunteers ( control group) were selected.In the observation group，10 cases were gradeⅡof NYHA functional classification，11 cases were gradeⅢand 9 cases were gradeⅣ.PBMC in the two groups were separated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation，and the relative expression of miR-155 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The miR-155 levels were compared between the observation group and the control group and among DCM patients with different NYHA functional classification.In the observation group，the left ventricular ejection fraction ( LVEF) and left ventricular end diastolic diameter ( LVEDd) were recorded by color Doppler ultrasound.The relationships between miR-155 levels and LVEF，LVEDd were analyzed in DCM patients.Results The relative expression levels of miR-155 in the observation group and control group were ( 0.50±0.24) and ( 1.00±0.23)，which showed a significant difference ( P＜0.01).The relative expression levels of miR-155 in NYHA functional classificationⅡ，Ⅲ，ⅣDCM patients were ( 0.77±0.10)，( 0.47± 0.10) and ( 0.23±0.08)，respectively.There were significant differences between each two groups ( all P＜0.01).In the observation group，the LVEF was 28%±10%，and the LVEDd was ( 70±7) mm.The miR-155 level was negatively

correlated with NYHA functional classification，LVEF and LVEDd in DCM patients ( r =－0.94，－0.67 and－0.53，P ＜0.05 or P＜0.01).Conclusions The expression level of miR-155 is down-regulated in PBMC of DCM patients and is correlated with the severity of impaired cardiac function.

Key words:dilated cardiomyopathy; microRNA-155; peripheral blood mononuclear cells; cardiac function

擴(kuò)張型心肌病( DCM)是以左心室或雙心室擴(kuò)大和收縮功能受損為特征、細(xì)胞免疫和體液免疫共同參與的自身免疫性疾病［1］，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA( microRNAs)是一類長(zhǎng)19～25個(gè)核苷酸、不具備蛋白質(zhì)編碼功能的單鏈小分子RNA，它們通過(guò)與靶mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)［2］。microRNA-155 ( miR-155)在造血細(xì)胞的分化、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、腫瘤的發(fā)生等多種生物學(xué)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［3］，但其與DCM發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性的報(bào)道較少。本研究觀察了miR-155在DCM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞( PBMC)中的表達(dá)情況，并探討其與心功能的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2013年12月～2014年12月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的DCM患者30例(觀察組)，其中男21例、女9例，年齡26～55( 41±12)歲; NYHA心功能Ⅱ級(jí)10例、Ⅲ級(jí)11例、Ⅳ級(jí)9例。均符合1995年WHO/ISFC制定的DCM診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，排除高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、肺心病、代謝性疾病患者。選取同期健康志愿者30例(對(duì)照組)，其中男20例、女10例，年齡23～58( 39±11)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 PBMC分離及miR-155表達(dá)檢測(cè)采集兩組空腹靜脈血5 mL于EDTA-K2抗凝管中，1 h內(nèi)采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC。TRIzol試劑從PBMC中提取總RNA，具體操作參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品在波長(zhǎng)260 nm和280 nm處的吸光度( A)值，A260/A280在1.8～2.0表示RNA純度較好。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-155相對(duì)表達(dá)量。miR-155、U6的逆轉(zhuǎn)錄和PCR引物均由廣州銳博公司設(shè)計(jì)、合成。miR-155上游引物: 5'- GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'，下游引物: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度60 bp;以U6為內(nèi)參，上游引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度94 bp。PCR反應(yīng)體系50 μL: 2 ×PCR Master Mix 25 μL，5 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，cDNA 5 μL，去離子水加至50 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃10 s，95℃15 s，60℃60 s，循環(huán)40次。通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析，miR-155相對(duì)表達(dá)量用2－ΔΔCt表示。實(shí)驗(yàn)用淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于美國(guó)GE公司，TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)于日本Shi madzu公司，Reverse Transcription System購(gòu)于美國(guó)Promega公司，SYBR Green PCR Master Mix Kit、實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3心功能檢查觀察組行彩色多普勒檢查(彩色多普勒超聲診斷儀，荷蘭Philips公司)，記錄左心室射血分?jǐn)?shù)( LVEF)和左心室舒張末期內(nèi)徑( LVEDd)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，多組間比較采用秩和檢驗(yàn)，兩組間比較采用單因素方差分析。觀察組PBMC中miR-155相對(duì)表達(dá)量與NYHA心功能分級(jí)及LVEF LVEDd的關(guān)系采用Spearman或Pearson相關(guān)分析P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組miR-155相對(duì)表達(dá)量比較觀察組miR 155相對(duì)表達(dá)量為0.50±0.24，對(duì)照組為1.00± 0.23;兩組比較，P＜0.01。

2.2觀察組不同NYHA心功能分級(jí)者miR-155相對(duì)表達(dá)量比較觀察組NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)者miR-155的相對(duì)表達(dá)量分別為0.77±0.10、0.47 ±0.10、0.23±0.08，多組間及組內(nèi)兩兩比較，P均＜0.01。

2.3觀察組miR-155相對(duì)表達(dá)量與心功能分級(jí)LVEF及LVEDd的關(guān)系觀察組LVEF為28%± 10%，LVEDd為( 70±7) mm。Spearman相關(guān)分析顯示，觀察組miR-155相對(duì)表達(dá)量與NYHA心功能分級(jí)呈負(fù)相關(guān)( r =－0.94，P＜0.01) ; Pearson相關(guān)分析顯示，觀察組miR-155相對(duì)表達(dá)量與LVEF LVEDd均呈負(fù)相關(guān)( r分別為－0.67、－0.53，P均＜0.05)。

3　討論

DCM是年輕人終末期心力衰竭和心臟移植的主要原因［5］，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。研究

顯示，部分病毒性心肌炎( VMC)可以演變?yōu)镈CM［6，7］，故有學(xué)者認(rèn)為VMC和DCM可能是同一疾病的兩個(gè)不同階段［8］。研究發(fā)現(xiàn)，DCM患者血清中存在多種抗心肌自身抗體［9］，以及輔助性T細(xì)胞( Th)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失衡［1，10］，表明細(xì)胞免疫和體液免疫可能均參與了DCM的發(fā)病過(guò)程。

miR-155是一個(gè)典型的多功能microRNA，對(duì)巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等多種炎癥免疫細(xì)胞均具有調(diào)節(jié)作用，可影響天然免疫和獲得性免疫過(guò)程，與多種免疫炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［11，12］。Satoh等［13］研究顯示，DCM患者心肌組織miR-155表達(dá)明顯低于左心室功能正常人群，提示miR-155可能負(fù)向調(diào)控DCM的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，觀察組PBMC中miR-155表達(dá)降低，說(shuō)明miR-155可能是DCM發(fā)生的一種保護(hù)性因子;而觀察組NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)者miR-155表達(dá)依次降低，且miR-155表達(dá)與NYHA心功能分級(jí)、LVEF、LVEDd均呈顯著負(fù)相關(guān)，以上均說(shuō)明miR-155表達(dá)與DCM患者心功能受損的嚴(yán)重程度有關(guān)，可作為判斷病情的指標(biāo)之一。

O'Connell等［14］、Murugaiyan等［15］研究證實(shí)，自身免疫性腦脊髓炎( EAE)小鼠PBMC中miR-155表達(dá)上調(diào)、Th1/Th17比例升高，而miR-155敲除的EAE小鼠Th1/Th17比例明顯降低。Yao等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在急性冠脈綜合征患者PBMC中表達(dá)明顯降低，而Th17細(xì)胞比例卻是升高的。以上說(shuō)明在不同的病理狀態(tài)下，miR-155對(duì)Th17有不同的調(diào)節(jié)作用。本研究樣本量偏少，沒(méi)有檢測(cè)T、B淋巴細(xì)胞等免疫相關(guān)指標(biāo)，因此對(duì)miR-155在DCM發(fā)病中的機(jī)制尚未明了，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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·基礎(chǔ)研究·

收稿日期:( 2015-06-11)

通信作者簡(jiǎn)介:汪朝暉( 1969-)，女，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樾难懿?曾獲教育部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)和湖北省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)和二等獎(jiǎng)各1項(xiàng)。E-mail: sgwangtjm@163.com

作者簡(jiǎn)介:第一顏小飛( 1979-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)樾难懿　-mail: yxfb329@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81170205)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 32-0020-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R542.21

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.007