胃動蛋白1在胃癌轉移中的作用及其機制探討

齊京鵬，史阿娉，豐帆，任貴，張洪偉( 西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，西安70077;西電集團醫(yī)院; 第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院)

胃動蛋白1在胃癌轉移中的作用及其機制探討

齊京鵬1，史阿娉2，豐帆3，任貴3，張洪偉3
( 1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，西安710077;2西電集團醫(yī)院; 3第四軍醫(yī)大學西京消化病醫(yī)院)

摘要:目的探討胃動蛋白1( GKN1)在胃癌轉移中的作用，及其是否與基質金屬蛋白酶( MMP)家族及NF-κB信號通路有關。方法取對數(shù)生長期的人胃癌細胞MGC803、MKN-45和非腫瘤性上皮細胞HFE-145，采用實時熒光定量PCR法檢測細胞GKN1 mRNA表達。將對數(shù)生長期的MKN-45細胞隨機分為轉染組、空載體組、對照組，轉染組轉染GKN1表達載體，空載體組轉染空載體，對照組不予處理。采用MTT法檢測各組轉染后連續(xù)5 d的細胞增殖活性，細胞劃痕試驗檢測劃痕寬度，Western blotting法檢測基質金屬蛋白酶2( MMP-2)、MMP-9、NF-κB p65蛋白表達。結果人胃癌細胞MGC803、MKN-45中GKN1 mRNA相對表達量分別為0.172±0.024、0.231±0.031，非腫瘤性上皮細胞HFE-145中GKN1 mRNA相對表達量為1.024±0.264;兩種人胃癌細胞GKN1 mRNA相對表達量均低于HFE-145細胞，P均＜0.05。培養(yǎng)第1、2天，轉染組、空載體組、對照組細胞增殖活性比較，P均＞0.05;培養(yǎng)第3、4、5天，轉染組增殖活性均低于空載體組、對照組，P均＜0.05。轉染組劃痕試驗后48、72 h的劃痕寬度均高于空載體組、對照組，P均＜0.05。轉染組MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白相對表達量均低于空載體組、對照組，P均＜0.05。空載體組、對照組上述指標比較，P均＞0.05。結論GKN1在胃癌細胞中呈低表達，激活其表達可顯著抑制腫瘤細胞轉移，可能與其抑制MMP家族蛋白表達及NF-κB信號通路有關。

關鍵詞:胃腫瘤;胃癌;胃動蛋白1;核因子-κB;基質金屬蛋白酶

Role and mechanism of gastrokine 1 in gastric cancer metastasis

QI Jing-peng1，SHI A-ping，F(xiàn)ENG Fan，REN Gui，ZHANG Hong-wei
( 1 The First Affiliated Hospital of Xi'an Medical College，Xi'an 710077，China)

Abstract:Objective To investigate the role of gastrokine 1 ( GKN1) in the metastasis of gastric cancer and to observe whether it is related with the matrix metalloproteinase ( MMP) family and NF-κB pathway.Methods Quantitative PCR was carried out to detect the GKN1 mRNA expression in the gastric cancer cell lines MGC803，MKN-45 and non-neoplastic epithelial cell line HFE-145 of the logarithmic phase.MKN-45 cells in the logarithmic phase were randomly divided into three groups: the transfection group ( group A)，non-load group ( group B) and the control group ( group C).Group A was transfected by GKN1 expression vector，group B was transfected by empty vector and the group C was not treated.MTT assay was used to detect the cell proliferation activities of the three groups for 5 days，cell scratch method was used to detect the scratch width，and Western blotting was employed to detect the protein expression of MMP-2，MMP-9 and NF-κB p65.Results The GKN1 mRNA relative expression levels of human gastric cancer cell lines MGC803 and MKN-45 were 0.172 ±0.024 and 0.231±0.031，and the GKN1 relative mRNA expression of the epithelial cells HFE-145 was 1.024± 0.264.The GKN1 mRNA expression of the two kinds of human gastric cancer cells was lower than that of HFE-145 cells ( all P＜0.05).No significant difference was found in the cell proliferation activity among the three groups of MKN-45 cells after being cultured for one or two days ( all P＞0.05).After being cultured for day 3，4 and 5，the cell proliferation activity of group A was lower than that of groups B and C ( all P＜0.05).The scratch width of group A after scratch test for 48

h and 72 h was higher than that of groups B and C ( all P＜0.05).The expression of MMP-2，MMP-9 and NF-κB p65 of group A was lower than that of groups B and C ( all P＜0.05)，and no significant difference was found between groups B and C ( all P＞0.05).Conclusions GKN1 in the gastric cancer cell lines shows lower expression and the activation of its expression can inhibit the metastasis of tumor cells，which may be related with its inhibition of MMP protein expression and NF-κB pathway.

Key words:stomach neoplasms; gastric carcinoma; gastrokine 1; nuclear factor-κb; matrix metalloproteinase

胃癌是一種消化道高發(fā)惡性腫瘤，具有高隱匿性及高轉移性，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經處于晚期進展階段［1，2］。胃動蛋白1( GKN1)編碼一種分子量為18 kD的胃竇黏膜蛋白，高表達于胃竇組織，在其他類型的胃腸黏膜組織中不表達［3］。GKN1可促進細胞分裂和增殖，具有促進胃黏膜損傷后愈合的作用。研究發(fā)現(xiàn)，GKN1可能具有胃癌特異性抑制基因的作用［4］; GKN1表達缺失時，胃黏膜上皮細胞不斷增殖而不凋亡［5］。2014年1月～2015年3月，我們觀察了GKN1在胃癌轉移中的作用，并探討其是否與細胞基質金屬蛋白酶( MMP)家族蛋白表達及NF-κB信號通路有關。

1　材料與方法

1.1材料人胃癌細胞MGC803、MKN-45和非腫瘤性上皮細胞HFE-145，均由ATCC( American Type Culture Collection)提供。pcDNA3.1表達載體、脂質體2000均購于美國Invitrogen公司，遺傳霉素G418購于日本W(wǎng)ako公司，逆轉錄試劑盒購于日本Takara公司。紫外分光光度儀購于美國NanoDrop公司，PRISM 7500熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.2 MGC803、MKN-45、HFE-145細胞培養(yǎng)及GKN1 mRNA檢測將MGC803、MKN-45及HFE-145細胞在加入10%熱滅活FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境37℃、5% CO2。取對數(shù)生長期細胞，采用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度儀檢測樣本濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒說明書操作，逆轉錄生成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測細胞GKN1 mRNA相對表達量。引物序列: GKN1上游引物: 5'-CAAAGTCGATGACCTGAGCA-3'，下游引物: 5'-CTTGCCTCTTGCATCTCCTC-3';以GAPDH為內參，上游引物: 5'-AAATCAAGTGGGGCGATGCTG-3'，下游引物: 5'-GCAGAGATGATGACCCTTTTG-3'。循環(huán)體系25 μL: SYBR premix( 2×) 12.5 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件: 94℃預變性4 min、95℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次; 72℃延伸1 min。采用瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，GKN1 mRNA相對表達量以2－ΔΔCt表示。

1.3細胞轉染及相關指標觀察

1.3.1細胞轉染將對數(shù)生長期的MKN-45細胞隨機分為轉染組、空載體組、對照組。逆轉錄獲取GKN1全長cDNA，將其克隆到pcDNA3.1表達載體通過脂質體2000轉染至轉染組;轉染后細胞培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)基，加入遺傳霉素G418，調整G418在培養(yǎng)基中的終濃度為1 mg/mL;細胞在G418存在的情況下培養(yǎng)8周，采用Western blotting法篩選穩(wěn)定轉染并表達GKN1的MKN-45細胞。空載體組轉染空載體;對照組不予處理，僅加入等量培養(yǎng)液。

1.3.2相關指標觀察

1.3.2.1細胞增殖活性采用MTT法。取各組細胞培養(yǎng)24 h后，接種于96孔板，調整細胞數(shù)為2× 103個/孔，每孔設兩個復孔。使用MTT試劑盒檢測細胞增殖活性，每孔加入5 mg/mL MTT，培養(yǎng)4 h后棄上清。加入150 μL二甲基亞砜，搖床低速震蕩10 min。采用酶標儀測定490 nm處各孔吸光度( OD值)，即細胞增殖活性，連續(xù)檢測5 d。

1.3.2.2細胞遷移力采用細胞劃痕試驗。調整各組細胞密度為5×104/mL，接種至6孔板中，每孔設兩個復孔。細胞完全貼壁后，用200 μL微量加樣槍頭在6孔板中劃出一條穿過貼滿孔底細胞的直線PBS洗去漂浮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)細胞。于劃痕試驗即刻及實驗后24、48、72 h，采用倒置顯微鏡觀察并記錄從遷移起點至遷移最遠點的細胞核間距，每個視野選擇10個觀測點。劃痕寬度越大，表示細胞遷移力越低。

1.3.2.3 MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白表達采用Western blotting法。取各組細胞，PBS沖洗2次，胰蛋白酶消化后收集細胞至2.0 mL離心管中加入預冷的含蛋白酶抑制劑RIPA的細胞裂解液150 μL，渦旋震蕩后離心，吸取上清，標準曲線法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE濃縮膠及分離膠電泳，轉印蛋白至PVDF膜; 5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育，洗膜3次;二抗孵育，洗膜3次;化學發(fā)光顯色定影。以GAPDH為內參，采用Fluorchem軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值表示。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1 MGC803、MKN-45及HFE-145細胞GKN1 mRNA相對表達量比較人胃癌細胞MGC803、MKN-45中GKN1 mRNA相對表達量分別為0.172 ±0.024、0.231±0.031，非腫瘤性上皮細胞HFE 145中GKN1 mRNA相對表達量為1.024±0.264;多組間比較，P＜0.05;兩種人胃癌細胞GKN1 mR NA相對表達量均低于HFE-145細胞，P均＜0.05。

2.2各組細胞增殖活性比較培養(yǎng)第1、2天，各組細胞增殖活性比較，P均＞0.05。培養(yǎng)第3、4、5天轉染組細胞增殖活性均低于空載體組和對照組，P均＜0.05。見表1。

表1　各組不同時點細胞增殖活性比較(珔x±s)

2.3各組劃痕寬度比較各組不同時點劃痕寬度比較，見表2。

表2　各組不同時點劃痕寬度比較(珔x±s)

2.4各組MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白相對表達量比較轉染組MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白相對表達量均低于空載體組、對照組，P均＜0.05;空載體組、對照組上述指標比較，P均＞0.05。見表3、圖1。

表3　各組MMP-2、MMP-9、NF-κB p65蛋白表達比較(相對表達量，珔x±s)

圖1　各組細胞MMP-2、MMP-9及NF-κB p65蛋白表達

3　討論

流行病學調查結果顯示，全球每年42%的胃癌新發(fā)患者來自中國，35%的胃癌死亡患者也來自中國。GKN屬于胃腸道黏膜特異性表達蛋白，其家族包括3個成員，即GKN1、GKN2、GKN3，主要表達于胃組織細胞，少量表達于子宮、胎盤和十二指腸細胞。研究發(fā)現(xiàn)，GKN1在胃癌組織中的表達顯著降低，具有胃癌特異性腫瘤抑制基因作用。本研究中人胃癌細胞MGC803、MKN-45中GKN1 mRNA相對表達量均明顯低于非腫瘤性上皮細胞HFE-145，與胃癌組織中的研究結果相一致，進一步證實了GKN1的抑癌基因作用。

為明確GKN1對胃癌轉移的作用及其機制，本研究構建了GKN1表達載體，并穩(wěn)定轉染至MKN-45細胞。結果顯示，MKN-45細胞轉染后的增殖活性遷移力顯著下降。侵襲和轉移是腫瘤重要的生物學特征，癌細胞轉移的前提條件是對相鄰胃黏膜細胞的細胞外基質和基底膜的破壞和降解，而MMP在這一過程中發(fā)揮重要作用［6］。MMP家族發(fā)揮降解細胞外基質和基底膜的作用，其中以MMP-2和MMP-9尤為顯著［7，8］。多種腫瘤組織中可見MMP-2 和MMP-9的高表達［9，10］，有研究顯示，胃癌組織中MMP-2的表達與胃癌浸潤程度及遠處轉移密切相關［11，12］。本研究結果顯示，隨著GKN1表達上調胃癌細胞MMP-2和MMP-9表達均明顯降低，說明抑制MMP家族蛋白表達是GKN1抑制腫瘤細胞轉移的機制之一。大量研究顯示，NF-κB可通過調控細胞凋亡而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［13］，其關鍵功能單位是p65亞基，多種腫瘤中可見NF-κB p65表達異常［14，15］。本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉染GKN1表達載體的MKN-45細胞NF-κB p65蛋白表達水平顯著降

低，提示GKN1的高表達會導致NF-κB p65的失活，繼而引發(fā)細胞增殖活性和遷移力的下降。

綜上所述，GKN1具有胃癌抑制基因作用，在胃癌細胞中表達降低;激活GKN1表達可顯著抑制胃癌細胞的增殖活性和遷移力，其機制可能與抑制MMP家庭蛋白表達和NF-κB信號通路有關。GKN1可作為胃癌診療的潛在靶點，為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供新的思路。

參考文獻:

［1］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012 ［J］.CA Cancer J Clin，2015，65( 2) : 87-108.

［2］Lee JH，Lim JK，Kim MG，et al.The influence of post-operative surveillance on the prognosis after curative surgery for gastric cancer［J］.Hepatogastroenterology，2014，61( 135) : 2123-2132.

［3］Mao W，Chen J，Peng TL，et al.Role of trefoil factor 1 in gastric cancer and relationship between trefoil factor 1 and gastrokine 1 ［J］.Oncol Rep，2012，28( 4) : 1257-1262.

［4］Yoon JH，Seo HS，Choi WS，et al.Gastrokine 1 induces senescence and apoptosis through regulating telomere length in gastric cancer［J］.Oncotarget，2014，5( 22) : 11695-11708.

［5］Yoon JH，Choi WS，Kim O，et al.The role of gastrokine 1 in gastric cancer［J］.J Gastric Cancer，2014，14( 3) : 147-155.

［6］Xu X，Chen L，Xu B，et al.Increased MT2-MMP expression in gastric cancer patients is associated with poor prognosis［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8( 2) : 1985-1990.

［7］Xia Y，Lian S，Khoi PN，et al.Chrysin inhibits tumor promoterinduced MMP-9 expression by blocking AP-1 via suppression o ERK and JNK pathways in gastric cancer cells［J］.PLoS One 2015，10( 4) : e124007.

［8］Jin G，Peng L，Zhang J，et al.Cancer and embryo expression pro tein 65 promotes cancer cell growth and metastasis［J］.Onco Lett，2015，9( 4) : 1772-1778.

［9］許俊龍，李玉紅，張杰，等.早期胃癌組織MMP-9、MLVD表達及臨床意義［J］.山東醫(yī)藥，2012，52( 31) : 41-42.

［10］葛夫軍.胃癌組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA的表達變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2014，54( 15) : 78-80.

［11］Han ME，Baek S，Kim HJ，et al.Development of an aptamer-con jugated fluorescent nanoprobe for MMP-2［J］.Nanoscale Res Lett 2014，9( 1) : 104.

［12］Wang HL，Zhou PY，Zhang Y，et al.Relationships between ab normal MMP2 expression and prognosis in gastric cancer: a meta analysis of cohort studies［J］.Cancer Biother Radiopharm，2014 29( 4) : 166-172.

［13］Jing H，Lee S.NF-κB in cellular senescence and cancer treatmen ［J］.Mol Cells，2014，37( 3) : 189-195.

［14］Tabata S，Ikeda R，Yamamoto M，et al.Thymidine phosphorylase activates NF-κB and stimulates the expression of angiogenic and metastatic factors in human cancer cells［J］.Oncotarget，2014，5 ( 21) : 10473-10485.

［15］Seo JH，Lim JW，Kim H.Differential Role of ERK and p38 on NF-κB Activation in Helicobacter pylori-Infected Gastric Epithelia Cells［J］.J Cancer Prev，2013，18( 4) : 346-350.

收稿日期:( 2015-06-19)

通信作者簡介:張洪偉( 1964-)，男，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤的診療工作。E-mail: zhanghw@ fmmu.edu.cn

作者簡介:第一齊京鵬( 1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事胸腹部腫瘤的診療工作。E-mail: qijing396@ sina.com

基金項目:國家自然科學基金青年基金資助項目( 81301804)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0001-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R573.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.001