RORγt、Foxp3在子宮內膜異位癥組織中的表達及意義

RORγt、Foxp3在子宮內膜異位癥組織中的表達及意義

吳晶晶1,2,陳雄2,黃娟2,梁小妍2,席曉薇1

(1 上海交通大學附屬第一人民醫院，上海200080；2 上海交通大學附屬第一人民醫院寶山分院)

摘要：目的探討卵巢子宮內膜異位囊腫組織中RORγt、Foxp3的表達規律，分析Th17、Treg細胞與子宮內膜異位癥的關系。方法選取病理學檢查確診的卵巢子宮內膜異位囊腫患者40例和單純因子宮肌瘤而行子宮切除手術患者38例，選取囊腫的囊壁組織和正常在位子宮內膜組織0.5 cm×0.5 cm，常規石蠟包埋備用，采用免疫組織化學技術檢測卵巢子宮內膜異位囊腫組織及正常子宮內膜組織中RORγt、Foxp3蛋白表達。結果RORγt、Foxp3蛋白在卵巢子宮內膜異位癥病灶組織中的表達均顯著高于正常子宮內膜組織(P均<0.05)；RORγt、Foxp3蛋白在卵巢子宮內膜異位病灶組織與正常子宮內膜組織中表達均有關聯(r分別為0.746和0.545，P均<0.05)。結論 組織局部微環境中Th17/Treg比例失衡可能是導致子宮內膜異位癥產生的原因之一。

關鍵詞：子宮內膜異位癥；孤獨核受體；叉頭狀轉錄因子；輔助性T細胞17；調節性T細胞

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.032

中圖分類號：R711.71

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)41-0077-02

收稿日期：(2015-05-01)

通信作者：席曉薇

子宮內膜異位癥(EMs)具有類似惡性腫瘤的一些特性，如具有侵襲、局部或遠處轉移、浸潤并損傷其他組織的能力[1]，其發生可能與免疫異常有著密切關系[2]。輔助性T細胞17(Th17)、調節性T細胞(Treg)被認為是參與EMs發生發展的重要免疫細胞成員[3]，其中孤獨核受體(RORγt)為Th17所特有的轉錄因子[4]，叉頭狀轉錄因子(Foxp3)為Treg細胞的特異性核轉錄因子。本研究通過免疫組織化學技術檢測卵巢子宮內膜異位囊腫組織及正常子宮內膜組織中RORγt、Foxp3蛋白表達，以探討Th17、Treg在EMs發病中的作用，繼而進一步明確其發病機制。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2013年1～12月上海第一人民醫院寶山分院婦科住院手術并經病理學檢查確診的卵巢EMs囊腫患者40例(觀察組)，年齡40～52歲，其中增殖期子宮內膜20例、分泌期子宮內膜20例；均排除合并糖尿病、高血壓、心血管疾病、妊娠、急慢性感染性疾病、結締組織病或既往有腫瘤病史者。另選取同期單純因子宮肌瘤而行子宮切除手術患者38例(對照組)，年齡44～55歲，其中增殖期子宮內膜19例、分泌期子宮內膜19例，其年齡及子宮內膜分期與觀察組比較無統計學差異。兩組均簽署知情同意書，并經本院倫理委員會審查批準。

1.2RORγt、Foxp3蛋白表達檢測檢測試劑鼠抗人Foxp3單克隆抗體(1∶50)購自eBioscience基因公司，鼠抗人RORγt抗體(1∶50)購自eBioscience基因公司，SABC三步法試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。選取觀察組囊腫的囊壁組織及對照組子宮內膜組織0.5 cm×0.5 cm，常規石蠟包埋備用。石蠟切片高溫高壓修復，行免疫組化染色，在顯微鏡高倍鏡下盲法閱片，半定量分析。RORγt、Foxp3蛋白陽性顆粒主要出現在間質浸潤的淋巴細胞中，定位于細胞核，染色為棕黃色或棕褐色。每張切片隨機選取5個有代表性的視野，根據染色強度及染色面積進行劃分。染色強度：無染色 0分，淺黃色 1分，棕黃色 2分，棕褐色3分；染色面積：無染色 0分，<30% 1分，30%～60% 2分，>60% 3分。兩項結果相加，0分為-，1分為+，2～4分為++，5～6分為+++。

1.3統計學方法采用SAS8.02統計軟件。兩種蛋白在兩獨立樣本(觀察組和對照組)等級資料的分析應用Wilcoxon 秩和檢驗；兩種蛋白在兩個樣本中的相關性采用Spearman等級相關進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組Foxp3蛋白表達陽性率觀察組40例，Foxp3蛋白表達陽性31例，其中13例+++，8例++，10例+，總體陽性率為77.5%。對照組38例，Foxp3蛋白表達陽性18例，其中1例+++，5例++，12例+，總體陽性率為47.4%。觀察組Foxp3蛋白表達陽性率高于對照組(Z=-3.687，P<0.05)。

2.2兩組RORγt蛋白表達陽性率觀察組40例，RORγt蛋白表達陽性30例，其中11例++，19例+，總體陽性率為75.0%。對照組38例，RORγt蛋白表達陽性17例，其中6例++，11例+，總體陽性率為44.74%。觀察組RORγt蛋白表達陽性率高于對照組(Z=-2.497，P<0.05)。

2.3Foxp3蛋白與RORγt蛋白表達的相關性觀察組卵巢子宮內膜異位病灶組織中Foxp3蛋白與RORγt蛋白表達相關(r=0.746，P<0.05)；對照組正常子宮內膜組織中Foxp3蛋白與RORγt蛋白表達也存在相關性(r=0.545，P<0.05)。

3討論

EMs發病的主要因素包括免疫防御功能缺陷和過度的炎癥反應。已有研究表明，異位的子宮內膜逃避了免疫監視，并利用免疫系統的促炎機制來促進異位內膜在腹腔內的生長[5]。EMs發展過程中的免疫缺失可能涉及兩個過程[6]。首先，異位損傷處樹突狀細胞減少及與之相關的無效抗原提呈，其次，分泌期增多的Treg數量可能與Treg調節抑制有關，Treg的表型能夠隨著促炎環境的不同而改變。由于異位子宮內膜的微環境是一種特殊炎癥環境，能夠被激活的、與免疫調節有關的分子機制所改變，Treg的功能也發生變化。這種功能變化的Treg無法招募免疫細胞高效識別和清除異位子宮內膜抗原，故發生代償性地過度增殖[7]。

Foxp3是Treg的特異性轉錄因子，在Treg細胞顯著表達。研究發現，在EMs患者在位及異位子宮內膜組織中都有Treg細胞，在30%異位子宮內膜組織標本中可以檢測出Foxp3陽性表達[8]。本研究中，在77.5%的子宮內膜異位病灶中可以檢出Foxp3陽性表達。有研究比較了卵巢EMs病灶和分泌期子宮內膜組織中的CD+4CD+25Foxp3陽性細胞亞群，發現卵巢EMs內膜組織中Treg細胞顯著升高[9]。本結果與上述研究相符，證明EMs病灶局部存在Treg功能失調引起的數量代償性增多導致的免疫防御功能缺陷。

EMs局部存在過度的炎癥反應。在EMs患者腹水中，細胞因子水平異常升高，如IL-1、IL-8、IL-6、TNF-α等促炎介質[6]。Th17細胞的主要效應因子是IL-17。IL-17可以刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生多種細胞因子如IL-6、IL-8、IL-1等；Th17細胞分泌產生IL-17A、IL-17F、IL-6以及TNF-α等，這些細胞因子可以集體動員、募集及活化中性粒細胞。以上兩方面都能有效地介導組織的炎癥反應，促進EMs的進展[7]。

RORγt誘導編碼IL-17 和IL-17F 細胞因子基因的表達，TGF-β 和IL-6 可通過誘導大量的RORγt 表達進而啟動RORγt 信號轉導通路，從而促進Th17 細胞的分化。本研究發現，EMs病灶中RORγt高表達，間接印證了在病灶局部富集的Th17細胞可能介導了EMs的炎癥反應，導致了其發生和發展。

正常狀態下，Th17細胞與Treg細胞處于平衡，兩者相互制約共同維護著內環境的穩定[7]。TGF-β能夠誘導受到TCR刺激的初始CD4+T細胞表達RORγt和Foxp3。二者為一對此消彼長的轉錄因子，在不同的細胞因子環境中處于動態平衡。由于EMs的病灶局部免疫環境發生了改變，使得Th17細胞與Treg細胞在局部病灶的平衡發生變化。但由于本研究是基于組織切片的免疫組化技術，結果僅能證明二者的表達變化在EMs內膜和正常子宮內膜之間有關聯，而不能證明二者是正相關或負相關。

參考文獻：

[1] Voloshchuk IN, Romadanova IA, Ishchenko AI, et al．Molecular biological aspects of the pathogenesis of adenomyosis[J]. Arkh Patol, 2007,69(3):56.

[2] Gazvani R, Templeton A. New considerations for the pathogenesis of endometrosis[J]. Int J Gynecol Obstet, 2002,76(2):117-126.

[3] Jennifer L Herington I, Kaylon L, et al. Immune interactions in endometriosis[J]. Expert Rev Clin Immunol, 2011,7(5):611-626.

[4] Park JS, Lim MA, Cho ML, et al. p53 controls autoimmune arthritis via the STAT3/STAT5-mediated regulation of the Th17-Treg balance in mice[J]. Arthritis Rheum, 2013,65(4):949-959.

[5] Pawel B, Krzysztof K. The biological role of Treg cells in ectopic endometrium homeostasis[J]. Histol Histopathol, 2014,29(10):1217-1233.

[6] Kalu E, Sumar N, Giannopoulos T, et al. Cytokine profiles in serum and peritoneal fluid from infertile women with and without endometriosis [J]. Obstet Gynaecol Res， 2007,33(4):490-495.

[7] Ivaylo I，Liang Z. Transcriptional regulation of Th17 Cell differentiation[J]. Semin Immunol， 2007，19(6): 409-417.

[8] Marina B, Alison J， Hey C, et al.The role of Foxp3 regulatory T-cells in endometriosis: a potential controlling mechanism for a complex, chronic immunological condition[J]. Human Reproduction, 2010，25(4)：900-907.

[9] Sakaguchi S, Vignali DA, Rudensky AY,et al. The plasticity and stability of regulatory T cells[J]. Nat Rev Immunol, 2013,13(6):461-457.