Toll樣受體4與腦缺血再灌注損傷的關系研究進展

楊楠，唐金榮

(1南京醫科大學第一臨床醫學院，南京210000；2南京醫科大學第一附屬醫院)

Toll樣受體4與腦缺血再灌注損傷的關系研究進展

楊楠1，唐金榮2

(1南京醫科大學第一臨床醫學院，南京210000；2南京醫科大學第一附屬醫院)

Toll樣受體4(TLR4)是先天性免疫系統的一種跨膜受體蛋白，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，可以識別外源性病原相關分子模式和內源性損傷相關分子模式，并啟動免疫應答。在腦缺血再灌注過程中，小膠質細胞、星形膠質細胞及損傷的神經元等產生并釋放大量的低分子透明質酸、熱休克蛋白等物質，作為內源性配體激活TLR4介導的信號通路，產生炎性級聯反應，在腦缺血再灌注損傷的發生、發展過程中發揮關鍵作用。

腦缺血；缺血再灌注損傷；Toll樣受體4；信號轉導

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指在腦缺血的基礎上恢復血液灌注后，腦組織損傷反而加重甚至發生不可逆損傷的現象。Toll樣受體4(TLR4)是先天性免疫系統的一種跨膜受體蛋白，可以識別外源性病原相關分子模式和內源性損傷相關分子模式，并啟動免疫應答。本文就近年來TLR4與CIRI關系的研究進展作一綜述。

1 TLR4結構、分布和配體

TLR4屬于I型跨膜糖蛋白受體，由胞外的配體識別結構域、跨膜區和胞內的信號轉導結構域3個部分組成[1]。胞外區參與識別外源性病原相關分子模式(PAMPs)和內源性損傷相關分子模式(DAMPs)，胞內區高度保守，是負責向下游傳遞信號的核心元件[2,3]。

TLR4幾乎分布于人類所有的細胞系，但主要表達于各種參與防御功能的細胞，如淋巴細胞、粒細胞、單核巨噬細胞等[4]。在人類腦組織中，神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞中均有TLR4表達，尤以小膠質細胞和星形膠質細胞表達較多[5]。正常鼠類動物的腦組織中也有少量TLR4表達，且以小膠質細胞為主。

TLR4不僅可以特異性識別外源性PAMPs，如革蘭氏陰性細菌的脂多糖、真菌的多聚糖、呼吸道合胞病毒的F蛋白等[6]；還可以特異性識別內源性DAMPs，這類配體在正常生理條件下不暴露于機體免疫系統，而是由組織和細胞發生損傷或應激時釋放，包括熱休克蛋白、高遷移率族蛋白1(HMGB1)、透明質酸、纖維蛋白原等[7]。

2 TLR4介導的信號轉導通路

TLR4與配體結合活化后將其信號傳遞給髓樣分化因子88(MyD88)或含TIR結構域誘導干擾素β接頭蛋白(TRIF)而發揮信號級聯效應，這兩條通路分別被命名為MyD88依賴性信號轉導通路和TRIF依賴性信號轉導通路[8]。

2.1 MyD88依賴性信號轉導通路 TLR4活化后通過激活MyD88而將信號傳遞給IL-1受體相關激酶(IRAKs)家族成員。IRAKs活化后與腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF-6)結合形成復合物，后者活化后再通過TAK-1結合蛋白(TAB)誘導激活轉化生長因子β激酶1(TAK-1)，繼而激活NF-κB誘導激酶(NIK)，使NF-κB抑制物激酶(IKK)復合體磷酸化而活化[9]。活化的IKK復合體(IKKα和IKKβ)誘導IκB泛素化而降解，使NF-κB游離活化并易位至細胞核與炎性調節基因的啟動子結合，促進TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等多種炎性細胞因子的轉錄與合成，啟動炎性級聯反應[10]。

此外，TAK-l還可以誘導MAPK激酶(MKK)家族發生磷酸化，繼而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，包括Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和細胞外信號調節激酶(ERK)，最終激活轉錄激活因子蛋白1(AP-1)，從而參與細胞的增殖、轉化與凋亡[11]。

2.2 TRIF依賴性信號轉導通路 在TRIF依賴性信號轉導通路中，活化的TLR4通過激活TRIF繼而將信號傳遞給下游的TRAF3或TRAF6而激活兩條不同的信號通路，產生不同的轉錄產物[12]。

TRAF3活化后與TRAF家族相關NF-κB激活劑(TANK)、TANK結合激酶1(TBK1)、IκB激酶ε(IKKε)結合形成復合物，使TBK-1和IKKε磷酸化而活化。活化的TBK-1和IKKε作為干擾素調節因子3(IRF-3)的激酶激活IRF-3。IRF-3活化后形成二聚體進入細胞核，結合于IFN-β基因上游的干擾素敏感反應元件(ISRE)，使IFN-β基因活化表達。

TRAF6被激活后，其后繼通路與MyD88依賴性信號通路基本相同，即活化的TRAF6繼而激活TAK-1，引起IKK復合體介導的NF-κB以及MAPK信號通路的激活。

3 TLR4與CIRI發生、發展的關系

在腦缺血再灌注的過程中，小膠質細胞、星形膠質細胞、血管內皮細胞、損傷的神經元等產生并釋放大量的低分子透明質酸、纖維蛋白原、熱休克蛋白60、熱休克蛋白70、硫酸肝素等物質，這些分子作為TLR4的內源性配體激活TLR4介導的信號轉導通路，最終產生大量的炎性細胞因子、趨化因子、細胞間黏附分子以及一些酶類物質等，啟動炎性級聯反應，在CIRI的發生、發展過程中發揮重要作用[13]。

Hyakkoku等[14]應用TLR3、TLR4、TLR9基因敲除小鼠與野生型小鼠進行對照研究發現，在腦缺血2 h再灌注24 h，只有TLR4基因敲除小鼠的腦梗死體積明顯小于野生型小鼠，推測TLR4可能在CIRI中發揮重要作用。在CIRI的過程中，內皮細胞等釋放大量的EDA+纖維蛋白原(EDA+-FN)。Khan等[15]發現，EDA+/+小鼠的腦梗死體積、神經功能缺損程度及COX2、NF-κB、TNFα、IL-1β、IL-6表達水平均顯著高于野生型小鼠；而在接受TLR4抑制劑處理的EDA+/+小鼠，上述指標則明顯下降；提示EDA+-FN可能通過TLR4介導的NF-κB信號通路參與CIRI。Yang等[16]分別通過臨床、細胞和動物實驗發現，急性腦梗死患者體內HMGB1水平顯著升高且與神經損傷程度相關；重組人HMGB1(rHMGB1)可以刺激小膠質細胞活化，并通過NF-κB通路產生NO，上調COX2、IL-1α、IL-1β、TNFα的轉錄和表達，而TLR4-/-小膠質細胞對rHMGB1無反應；向腦缺血再灌注小鼠模型側腦室注射rHMGB1，TLR4+/+小鼠的神經功能損害明顯加重，而TLR4-/-小鼠則無明顯變化；由此證實，HMGB1/TLR4信號通路通過誘導小膠質細胞活化在CIRI的炎癥機制中發揮重要作用。Gao等[17]發現，在腦缺血再灌注組小鼠的腦組織內，TLR4、MyD88及其下游TNF-α的表達水平顯著升高；而在TLR4抗體預處理組，MyD88、NF-κB及其下游炎性細胞因子的表達水平則顯著下降；提示TLR4-MyD88依賴性信號轉導通路在腦缺血再灌注時被激活，并在CIRI的發展過程中發揮重要作用。Hua等[18]研究發現，TLR4基因敲除小鼠的腦梗死體積、神經元凋亡數量、NF-κB激活程度均顯著低于野生型小鼠。Weinstein等[19]在缺氧—缺糖條件下培養小鼠小膠質細胞(BV-2)，體外模擬CIRI，結果顯示TLR4和NF-κB mRNA表達量均顯著上調，其下游炎性細胞因子水平也顯著增加。

上述研究都表明，TLR4在CIRI的病理生理過程中發揮重要作用，缺血再灌注可以激活TLR4表達，TLR4信號通路激活和TLR4表達上調可以引起并加重局部腦損傷，而TLR4功能缺失則可產生神經保護效應。

4 TLR4通路的炎性細胞因子與CIRI發生、發展的關系

在腦缺血再灌注過程中，內源性配體通過TLR4信號通路激活NF-κB，最終誘導促炎因子、趨化因子、黏附分子等物質的大量表達形成炎癥瀑布，是加重腦損傷的中心環節。在NF-κB下游的炎癥因子中，尤以IL-1β和TNF-α的作用突出和研究最多。NF-κB活化可以增強IL-1β和TNF-α的轉錄水平，而IL-1β、TNF-α又是NF-κB的激活劑，這種正反饋效應可以導致NF-κB在細胞內持續活化，是導致神經元發生不可逆損傷的關鍵環節。

IL-1β是一種免疫源性細胞因子，具有強烈的趨化作用。腦缺血時IL-1β含量增加，可誘導中性粒細胞和巨噬細胞向損傷區域遷移和浸潤，并釋放多種炎性介質，加重炎癥反應。IL-1β還可以上調細胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達，增強白細胞與內皮細胞間黏附，誘導內皮細胞產生促凝血因子，促進血管內血栓形成。另外，IL-1β還可導致興奮性氨基酸、自由基、NO、蛋白水解酶等釋放增加，產生神經毒性，誘導神經元凋亡。

在中樞神經系統內，神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞是TNF-α的主要來源。在正常情況下，TNF-α的少量表達具有神經修復作用，而在腦缺血再灌注的過程中，TNF-α表達顯著增加可加重腦損傷。與IL-1相似，TNF-α也可刺激ICAM-1表達增加和誘導興奮性氨基酸、氧自由基等神經毒性物質產生。另外，TNF-α可激活血管內皮細胞，使血管通透性增加，并誘導內皮細胞產生和釋放IL-1及組織因子，同時抑制抗凝及纖溶系統的活性，與IL-1協同作用，促進血栓的形成。TNF-α還可促使星形膠質細胞和小膠質細胞中IL-1、IL-6等炎癥因子，以及具有細胞毒性的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達增加，產生協同促炎作用，加重神經細胞損傷。

5 TLR4與CIRI治療的關系

近幾年來，隨著TLR4信號通路在CIRI中的研究深入，以TLR4為靶點的治療也取得了突破性的進展。大量的動物實驗表明，多種化學藥物通過作用于TLR4及其上游或下游的信號分子在CIRI過程中發揮腦保護作用，如：棓酸丙酯可以抑制熱休克蛋白70及其介導的TLR4通路中NF-κB、COX-2和TNF-α的表達[20]；藁苯內酯通過抑制髓過氧化物酶-6介導的TLR4信號傳導通路發揮神經保護作用[21]；木犀草素通過下調TLR4、TLR5、NF-κB、p38MARK表達，上調ERK表達，發揮缺血后腦保護作用[22]；胡黃連苷Ⅱ、銀杏內酯B和黃芩苷等通過抑制TLR4、NF-κB及下游COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β表達減輕CIRI。研究證明，電針刺激曲池和足三里可以抑制TLR4-NF-κB信號通路及其下游炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達，進而發揮神經保護和抗炎作用。大鼠腦缺血前3周或再灌注第5天進行跑步機訓練，通過抑制腦組織中TLR2、TLR4及其下游分子MyD88、NF-κB表達，促進神經功能恢復。

綜上所述，抑制TLR4表達及其上下游信號通路轉導能有效保護CIRI。但是，這些研究主要局限于基礎研究，真正能應用于臨床的成果尚少，仍需要進一步研究以篩選出一種靶向阻斷TLR4并可能在今后的臨床實踐中應用的藥物。另外，由于TLR4在機體正常免疫系統中也發揮重要作用，但其功能及機制還不完全清楚，以TLR4為靶點的治療是否會對正常免疫系統造成不良影響尚需進一步研究證實。

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唐金榮，E-mail: zdgaoyang@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.043

R743

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1002-266X(2015)12-0103-03

2014-07-01)