腸桿菌科細菌外排泵AcrAB-TolC調控機制的研究進展

程玉謙，祁偉(天津醫科大學第二醫院，天津300211)

腸桿菌科細菌外排泵AcrAB-TolC調控機制的研究進展

程玉謙，祁偉
(天津醫科大學第二醫院，天津300211)

摘要:AcrAB-TolC外排泵廣泛存在于腸桿菌科細菌中，其基因表達水平的提高對臨床菌株多重耐藥起重要作用。細菌AcrAB-TolC外排泵系統產生多重耐藥性的機制是將細菌細胞內的抗生素主動泵出，使細胞內藥物濃度下降。外排泵AcrAB-TolC的調控主要有局部調控和全局調控兩種方式，調節基因AcrR、marOR、ramR及soxRS的突變可以導致AcrAB操縱子過表達，有助于細菌產生多重耐藥表型。

關鍵詞:腸桿菌科;外排泵;調控機制;多重耐藥

主動外排機制對細菌多重耐藥性的產生起重要作用［1，2］。AcrAB-TolC外排泵由細菌外膜通道蛋白TolC、內膜外排轉運蛋白AcrB及膜融合蛋白AcrA組成。其中AcrA位于周質間隙，連接AcrB和TolC，以三聚體形式穿越細菌內膜和外膜，主動將菌體內的物質泵出細胞外。現已證實，外排泵AcrABTolC廣泛存在于腸桿菌科細菌(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、產氣腸桿菌、志賀菌等)中，是重要的外排系統，它受局部調節因子AcrR及全局調節因子MarA-SoxS-Rob系統的調控［3，4］。本文對腸桿菌科細菌外排泵AcrAB-TolC調控機制的研究進展作一綜述。

1　外排泵AcrAB-TolC對細菌多重耐藥的作用機制

外排泵AcrAB-TolC以質子驅動力為能源，通過AcrB捕獲和轉運底物。AcrB的外周胞質發夾環具有結合藥物分子的作用，當AcrB與藥物分子結合時，其構象發生改變，隨之通過級聯放大效應，進一步引起AcrA和TolC構象改變，AcrB和TolC相互接觸，通道開放。在生理狀態下，AcrAB-TolC的表達有助于菌株抵抗腸道的膽鹽、脂肪酸等疏水性物質的入侵;但AcrAB-TolC的高表達表現出對多種化合物的耐受，如各種抗生素(β-內酰胺類抗生素、四環素、氯霉素、大環內酯類、甲氧芐啶及喹諾酮類抗生素等)以及其他毒素復合物(吖叮黃、三氯生、去污劑、染料和有機溶劑)。外排泵系統可將細菌細胞內的抗生素主動泵出，使細胞內藥物濃度下降。近年來研究證實，AcrAB-TolC外排基因高水平表達對于臨床菌株多重耐藥性有重要作用［5，6］。

2　腸桿菌科細菌外排泵AcrAB-TolC的調控方式

外排泵AcrAB-TolC的調控主要有局部調控和全局調控兩種方式，其局部調控蛋白主要為AcrR，全局調控蛋白主要有MarA、Rob、SoxS、RamA等。調節基因AcrR、MarOR、RamR及SoxRS的突變可以導致AcrAB操縱子的過表達，有助于細菌產生多重耐藥表型。

2.1局部調控AcrR是一種負性調控因子，包括215個氨基酸，由位于泵基因上游141 bp的阻遏基因AcrR編碼，與AcrAB啟動子上的24個堿基對構成的反轉重復序列結合，抑制自身及AcrAB基因的表達。AcrR同轉錄抑制子TetR有共同的N末端序列和相似性結構。AcrR折疊形成9個α-螺旋結構，由DNA結合區和配體結合區組成。N末端的3個螺旋區形成典型的螺旋-轉角-螺旋結構，是其與DNA鏈的結合位點，結構相對保守; C末端區為底物結合位點，形成1個配體結合口袋，能夠調節多種配基，表明AcrR是一種多藥結合蛋白。當AcrR與底物結合后，N端即與DNA鏈分離，啟動AcrAB基因表達。AcrR抑制子的突變有助于AcrB的過表達。研究發現，AcrR第45位氨基酸位于螺旋-轉角-螺旋DNA結合區的中間，這一位點相對保守，其突變會導致AcrAB表達增加，在抗生素耐藥性中起重要作用［7］。AcrAB的過表達不依賴于AcrR的活性，但是當AcrAB過表達后，AcrR的活性在調節AcrAB的表達中可能起到重要作用。沙門菌中AcrR的突變導致75位異亮氨酸和76位谷氨酸的復制，有助于AcrAB的過表達。

2.2全局調控調節因子MarA、SoxS、Rob及RamA屬于AraC/XylS家族，共同構成MarA-SoxS-Rob調控系統，作為單體結合由20 bp組成的非對稱序列AYNGCACNNWNNRYYAAAYN (N代表任何堿基，R代表A或G，W代表A或T，Y代表C或T)，這個結合位點稱為marbox。marbox出現在調節基因(如AcrAB、TolC、MarRAB)啟動子上游; SoxS和MarA結合到marbox的不同基因，不同程度地激活AcrAB轉錄而提高外排泵表達。調節基因表達水平的提高同操縱子的基因突變或誘導劑的結合位點突變有關。此外，這些轉錄調節因子之間也存在交叉調節作用，如SoxS的缺失可以降低MarA的表達，反之亦如此。

2.2.1MarRAB操縱子Mar操縱子是細菌對外界環境壓力反應的調控中心。Gorge等于1983年首次在大腸埃希菌染色體上發現Mar操縱子，后證實其廣泛存在于腸桿菌科細菌中;其序列在腸桿菌科細菌中相對保守，在細菌多重耐藥中起重要作用。MarRAB操縱子包括:啟動子MarO、阻遏基因MarR及陽性轉錄調節子MarA、MarB。MarR是Mar操縱子轉錄阻遏蛋白，以同二聚體形式與MarO結合，負性調節MarRAB的轉錄; MarA是一種轉錄激活蛋白，與MarRAB操縱子上游區MarO中的Marbox結合，不僅調節自身轉錄，也調節Mar調節子的表達;目前MarB的功能未知。Vinué等［8］研究結果表明由216 bp基因編碼的MarB作為胞質周質蛋白，可能作為一種參與細胞調節因子的信號，抑制Mar-RAB啟動子。MarRAB的轉錄亦可由MarA的同系物SoxS和Rob激活。在氟喹諾酮耐藥的大腸桿菌中，MarR抑制子的突變導致MarRAB操縱子的組成型表達［9］; MarR抑制子暴露于水楊酸鹽也可以減低RarR的抑制作用，提高MarA的表達。研究認為MarOR基因第1 376～1 379處的4個堿基缺失，可使志賀菌對部分抗生素的耐藥性增加［10］。

2.2.2SoxS和Rob SoxS屬于AraC/XylS家族成員之一，是SoxRS超氧化反應調節子的效應基因，受SoxR正向調節。SoxR是一種組成型表達的同二聚體轉錄調節子，它包括具有氧化還原活性的鐵-硫簇;這些鐵-硫簇的氧化反應激活SoxR，從而觸發了SoxS基因的轉錄。在大腸桿菌及沙門菌臨床株和實驗株中，SoxRS調節子的激活有助于提高菌株對喹諾酮、奈叮酸和氯霉素的耐藥性。SoxS的組成型表達源于SoxR C末端的突變。在體外誘導耐藥的大腸桿菌突變株中發現SoxR第125位天冬酰胺被賴氨酸代替，這個位點臨近包括4個半胱氨酸的C末端簇，導致SoxS的過表達。Zheng等［11］研究結果表明，在氟喹諾酮耐藥的鼠傷寒沙門菌LTH中，SoxR基因出現3個堿基替代(T313、C317、C321)，產生了兩個氨基酸殘基的改變，導致SoxS的過表達并參與了細菌對氟喹諾酮的耐藥性。O' Regan等［12］也發現SoxR的突變(第20位精氨酸變為組氨酸)提高了SoxS的表達并有助于沙門菌產生多重耐藥性。Fàbrega等［13］發現，在諾氟沙星體外誘導耐藥的大腸埃希菌突變株NorE5中，SoxS和MarA的表達水平明顯提高;對SoxRS的測序發現在402位插入兩個腺嘌呤，在134位賴氨酸處插入1個讀碼框，在7個密碼子后產生了終止子，使得C末端的氨基酸缺失;此外該研究也提示MdtG基因是MarASoxS-Rob調控系統中的一部分，其產物MdtG過度表達能夠導致耐藥性增加，MdtG的marbox破壞后，MarA、SoxS、Rob的誘導能力均下降。相關研究表明，SoxR 136～144位氨基酸的缺失(影響最后19個氨基酸)也可導致SoxS的組成型表達。Kehrenberg等［14］在沙門菌中發現SoxR基因內49個堿基插入參與SoxS上調及提高了外排活性。在大腸桿菌中，Rob的過表達通過激活AcrB而賦予細菌多重耐藥表型。

2.2.3RamA除了MarA/SoxS/Rob家族，George等［15］發現并證實了RamA作為AraC/XylS家族的另一成員，對克雷伯菌的多重耐藥性起到重要作用。最近相繼在陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌及沙門菌中發現RamA基因; RamA結合位點位于AcrAB基因上游，是沙門菌外排泵AcrAB-TolC的主要調節因子，其主要作用是促進AcrAB基因的表達，有助于細菌對氟喹諾酮及多重耐藥性的產生［16］。RamR位于RamA基因上游，作為RamA的抑制子調節RamA基因的表達。RamR的結合位點覆蓋RamA啟動子的主要特征，包括-10保守區、RamA的轉錄起始位點和2個長7 bp的翻轉重復序列。RamR及RamRRamA區的基因突變在RamA和AcrAB的上調中起重要作用，從而賦予泵介導的多重耐藥表型。相關研究發現，RamR區6個氨基酸(T18P、R46N、R46P、Y59H、M84I和E160D)的替代同細菌的多重耐藥性相關［14，16，17］。在鼠傷寒沙門菌中，由RamR點突變所致氨基酸的替代或框移位、RamA啟動子的缺失以及由于IS1啟動子的插入導致RamR的失活均導致了外排泵基因表達水平的提高及多重耐藥性的產生。Abouzeed等［16］報道在鼠傷寒沙門菌DT104中，RamA上游2個堿基對的缺失在RamA和AcrAB的上調中起重要作用;而Zheng等［18］的研究表明在氟喹諾酮耐藥的沙門菌中，RamA啟動子區9個堿基的缺失，其中也包括Abouzed報道的2個堿基的缺失，推測可能是RamR的結合位點，激活了RamA。Kehrenberg等［14］發現在沙門菌中RamR-RamA區不同位置的突變及SoxR基因的突變均可導致AcrAB外排泵的上調，包括點突變、RamR基因10～15個堿基缺失以及RamR結合位點的單個堿基的替代。Zheng等［18］的研究結果表明，組成型RamA轉錄水平的提高可以導致細菌多重耐藥表型，在菌株LTL中，最低抑菌濃度水平的提高伴隨AcrAB和RamA的組成型過表達;而已知的調節子如MarA和SoxS的表達水平沒有變化，表明RamA是AcrAB表達的激活子。

綜上所述，外排泵AcrAB-TolC對腸桿菌科細菌多重耐藥性起重要作用，而其復雜的調控機制需要進一步研究和探索，為新型抗菌藥物或外排泵抑制劑的研究提供重要的靶作用位點;此外，通過對外排泵AcrAB-TolC結構和調控機制的深入研究，為細菌其他外排系統的研究提供思路。

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(收稿日期:2015-01-06)

通信作者:程玉謙

基金項目:天津醫科大學科學基金資助項目(2010KY47)。

文章編號:1002-266X(2015)21-0095-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R378.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.039