小檗堿抗結直腸癌機制研究

趙雨佳，龔 丹，程亞齡

小檗堿又稱黃連素，是從黃連屬植物根莖中提取的一種異喹啉類季銨生物堿，在我國傳統醫學中有悠久的使用歷史，其主要藥理作用包括抗心律失常、降低膽固醇、改善胰島素抵抗、抑菌、抗炎和抗抑郁等［1，2］。近年來諸多研究均發現，小檗堿具有良好的抗腫瘤作用，能夠有效抑制各種不同組織來源的惡性腫瘤，其作用機制涉及腫瘤細胞增殖、凋亡、遷徙、轉移等各個環節，且針對不同類型的腫瘤，其作用機制也不盡相同［3，4］。結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康，目前其治療手段是手術、化療、放療相結合的綜合治療［5］，對其治療方法進行研究，仍然是目前的研究熱點，開發效率高、作用明顯、不良反應低的新藥已成為研究的新方向。

目前已有許多研究證實，在體內、體外實驗中小檗堿均能有效抑制結直腸癌，且其對正常腸黏膜細胞的損傷作用較輕。針對小檗堿抗結腸癌機制的研究主要集中在抑制腫瘤細胞的形成、誘導凋亡、抑制增殖、影響擴散等方面［6］。

1 抑制腫瘤細胞的形成

氧化損傷能夠誘導正常細胞向腫瘤細胞轉化，抗氧化作用是小檗堿抑制腫瘤形成的靶點之一。Thirupurasundari等［7］通過氧化偶氮甲烷（AOM）15 mg／kg皮下注射形成Wistar大鼠結腸癌模型，分別在造模過程中及造模后給予30 mg／kg小檗堿灌胃處理。結果發現AOM誘導組發生了脂質過氧化損傷和抗氧化防御系統的改變，小檗堿與AOM共同和先后作用均能活化和增強細胞內多種還原酶SOD、過氧化氫酶、GST、GSH及維生素C、E的活性，消除AOM誘導產生的氧化物LPO、ROS，同時小檗堿干預后血清中糖蛋白的下降水平也具有統計學意義。此外，電鏡下細胞超微結構顯示小檗堿作用后，腸上皮細胞出現核固縮、核染色質邊集、線粒體腫脹和內膜嵴減少等凋亡特征性變化。證明小檗堿通過抗氧化作用抑制正常細胞向腫瘤細胞的轉化，從而發揮抑制腫瘤形成的作用。

吳 柯 等［8］以 二 甲 肼 （1，2－dimethylhydrazine，DMH）40 mg／kg皮下注射＋1%葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）水溶液飲用誘導形成大鼠結腸癌模型，觀察小檗堿和美洛昔康灌服后，連續16周后大鼠體重、異常隱窩灶（abrrant crypt foci，ACF）和結腸癌發生率的變化。結果發現與模型組相比，小檗堿明顯改善DMH＋DSS誘癌過程中大鼠惡病質狀態并遏制體重減輕，顯著減少實驗第10周結腸ACF數、明顯降低結腸癌的發生率，其作用與美洛昔康組相似。

2 誘導腫瘤細胞凋亡

2．1 小檗堿通過線粒體途徑誘導凋亡 小檗堿主要通過影響ROS相關的信號通路JNK／p38 MAPK、PKC、ERK等來激活線粒體途徑，通過內源性線粒體凋亡通路發揮誘導凋亡的作用［9，10］。Wang 等［11］將小檗堿50 μmol分別作用于結腸癌IMCE細胞1、3、6、18、24 h 和12．5、25、50、100 μmol小檗堿分別作用IMCE細胞18 h后，結果發現作用時間18、24 h、小檗堿濃度50、100 μmol能顯著誘導細胞死亡；同時測定凋亡標志物LDH的水平，其釋放量與小檗堿呈濃度和時間依賴性。他們測定了與外源性凋亡通路相關的 caspase－3、－6、－9、－12，發現均未被活化，同時caspase抑制劑zVAD－fmk無法緩解小檗堿的抑制作用；又通過Annexin X／PI染色法確定小檗堿作用后 Annexin X（＋）／PI（＋）細胞的數量明顯增加，因此他們認為小檗堿通過線粒體途徑發揮作用。Wang等進一步研究發現小檗堿作用于IMCE細胞后濃度依賴性地增加了ROS的量，ROS誘導了溶酶體中組織蛋白酶B（cathepsin B）的釋放，引起了線粒體膜的去極化，存在于線粒體內膜間隙的可溶性蛋白——凋亡誘導因子 （apoptosis inducing factor，AIF）通過外膜被釋放出來，最終引起細胞的程序性死亡。

Hsu 等［12］將小檗堿不同劑量組 5、10、25、50μmol，不同作用時間 3、6、12、24 h作用于 SW620細胞，MTT實驗測定細胞增殖活性結果發現小檗堿濃度越高、作用時間越長，抑制生長作用越明顯；超微形態學觀察、DAPI染色、Annexin－V染色等均證明小檗堿誘導了細胞凋亡。又通過對氧化物敏感的DHE染色法檢測ROS的水平、Western blotting法檢測細胞色素C、PARP裂解物的量及MAPK通路的p38／MAPK、JNK、ERK的磷酸化水平，發現明ROS和MAPK通路有關，ROS能夠時間依賴性地磷酸化JNK和p38，活化相應的MAPK通路，從而磷酸化激活了轉錄因子C－Jun，最終導致細胞色素C的釋放。

Murthy等［13］發現小檗堿可直接引起線粒體膜的破壞從而導致凋亡。他們用rhodamine－123染色法測定線粒體膜電位，發現50 μmol小檗堿作用24、48、72 h 后線粒體膜電位分別下降 30%、27．5%、25%，膜通透性增加，細胞色素C從線粒體中釋放，形成了由細胞色素C、連接蛋白Apaf1和caspase－9酶原組成的凋亡復合體，啟動Caspase激活事件的級聯反應，引起底物發生蛋白水解反應，細胞最終死亡。Li等［14］和 Jantova 等［15］也都觀察到小檗堿誘導ROS的產生，引起細胞內Ca2＋濃度的升高和線粒體膜電位的下降進而去極化，細胞色素C釋放激活凋亡通路。

2．2 小檗堿影響凋亡相關分子的表達 在腫瘤細胞凋亡過程中，小檗堿能夠影響caspase、抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白、Fas和FasL等的表達。Yan等［16］用流式細胞術檢測 10、25 μg／ml小檗堿作用于BIU－27和T24細胞48 h后的凋亡比例，BIU－27和T24 細胞在對照組、10 μg／ml作用組、25 μg／ml作用 組 分 別 為 0．04% 、7．7% 、19．61% 和 0．06% 、11．41%、54．40%，均具有統計學意義； 同時用Western blotting法測定 caspase－3、－9 及其裂解物的含量變化，caspase－3、－9 的量沒有明顯變化，但它們的裂解物在小檗堿作用后呈濃度依賴性上升，他們認為小檗堿誘導凋亡與caspase－3、－9活化有關。Ho等［17］的研究也得出相似的結論，小檗堿能夠明顯提高 caspase－3、－8、－9 的活性，提高凋亡水平。Patil等［18］測定小檗堿作用后腫瘤細胞中DNA的碎片量和凋亡標志物PARP裂解物的變化，結果顯示25 μmol小檗堿作用72 h后DNA碎片和PARP裂解物的量明顯增加，證明細胞凋亡增加；作用48、72 h后，抗凋亡蛋白Bcl－2的水平與未干預組比明顯減少。Lu等［19］運用RT－PCR測定小檗堿作用組Fas、FasL mRNA的表達水平，發現分別為對照組的4．69、1．31 倍 ，Fas、FasL 分 別 為 對 照 組 的 214．02、28．84 倍，同時 TNF－α mRNA、TNF－α、TRAF－1 較小檗堿干預前均有明顯增高。

2．3 小檗堿調控凋亡相關轉錄因子的表達 NAG－1和ATF3是與細胞凋亡相關的轉錄因子，他們編碼的蛋白質參與細胞凋亡、并且能夠抑制腫瘤細胞的形成，研究表明其在正常細胞中的表達水平明顯高于腫瘤細胞［20］，且能夠被多種抗炎、抗癌藥物激活［21］。Piyanuch 等［22］測定了 50μmol小檗堿作用 24 h后不同結腸癌細胞中NAG－1和ATF3的表達水平，其中CaCo－2中 NAG－1表達增加，SW480中 ATF3表達增加，HCT－116中 NAG－1和 ATF3表達均增加，證明小檗堿的誘導效應具有細胞特異性；進一步研究證明小檗堿通過對p53的活化誘導ATF3的表達，通過對 ERK1／2、PKC、GSK－3β 蛋白激酶通路的作用誘導NAG－1的表達。

2．4 小檗堿具有遺傳毒性 Liu等［23］發現小檗堿通過p53活化途徑發揮DNA的損傷作用，通過免疫熒光染色和免疫印跡法測定γ－H2AX的含量以及微核試驗，發現γ－H2AX和微核的量隨小檗堿量的升高而升高。此外還有研究表明小檗堿在一定的pH條件下，能夠直接與腫瘤細胞DNA結合形成DNA－小檗堿復合物［24］，且與 polyA的結合能力強于polyU、polyC；導致DNA雙螺旋解聚，活化p53和 ATM（ataxia telangiectasia mutated），最終誘導細胞凋亡［25］。還能與mRNA結合，抑制移位和轉錄，同時可以部分嵌入tRNA，干擾氨基酸的轉運［26］。

2．5 小檗堿影響細胞膜離子通道的開放 陳明鍇等［27］將 0．1、0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗堿作用于HT－29 細胞 24、48、72、96 h 后，MTT 檢測細胞增殖、流失細胞術檢測凋亡率發現抑癌率和凋亡率較對照組明顯增高；膜片鉗檢測延遲整流鉀通道IK（V）發現 0．1、0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗堿能濃度依賴性抑制 HT－29細胞 IK（V），階躍刺激為＋80 mV 時，對照組、0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗堿組 IK（V）分別為（488±42）、（372±22）、（296±25）、（225±34） pA，0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗堿組 IK（V）分別為對照組的（77．16±5．41）%、（61．35±6．09）%、（45．87±7．62）%，他們認為小檗堿通過抑制結腸癌細胞IK（V）的開放抑制增殖并誘導凋亡。劉善文等［28］使用高滲和低滲灌流液以及氯通道阻斷劑研究小檗堿激活的SW480全細胞氯電流的生理學和藥理學特性，小檗堿（10 nmol／L）可誘發 SW480細胞迅速產生氯電流，該電流沒有明顯的時間依賴性失活和電壓依賴性失活，細胞外灌流高滲液可幾乎完全抑制小檗堿激活的氯電流，而低滲液外灌流可激活一個氯電流，其特性與小檗堿激活的氯電流相似，氯通道阻斷劑NPPB、tamoxifen能顯著抑制小檗堿激活的氯電流。以上實驗結果提示，小檗堿可以激活細胞膜上的氯通道，且氯通道對氯通道阻斷劑和細胞容積變化敏感，進而通過改變離子通道的活動來影響細胞周期、增殖以及細胞凋亡。

3 抑制腫瘤細胞增殖

目前研究已發現小檗堿主要通過對周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）、周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（CKI）的調控阻斷細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖。He 等［29］觀察到 10、40、80 μmol小檗堿作用于QBC939細胞后，MTT法測定在24、48 h兩個時間點的吸光度值均顯著小于對照組，同時80 μmol小檗堿作用于正常腸上皮細胞HIBEC 48 h后未觀察到明顯的細胞毒作用，證明小檗堿在抑制腫瘤細胞增殖的同時對正常細胞的毒作用較小。流式細胞術測定結果發現G1期細胞明顯增加、S期細胞明顯下降，細胞周期被阻斷在G1－S階段；進一步western blotting法測定G1期到S期的周期相關蛋白發現，小檗堿發揮上調作用是通過上調CKI p21、p15，同時減少Cdk2和Cdk4的活化。Liu等［30］也觀察到小檗堿抑制腫瘤細胞的生長，且呈濃度和時間依賴性；流式細胞術測定G1期細胞比例上升的同時S期細胞下降，又將BrdU作為標記物證實進入S期的細胞減少，從而認為細胞周期停滯在G1－S階段。同時發現G1－S期停滯與p53基因的作用有關，小檗堿能夠濃度依賴性地引起p53蛋白水平的上升；p53突變細胞株中，G1、S期細胞數量及比例較對照組沒有明顯變化，阻滯細胞周期的作用減弱，他們得出結論小檗堿通過p53依賴的途徑調節cyclin E、cyclin D1，阻滯細胞增殖的正常進行。

Cai等［31］通過 WST－1 實驗和克隆形成實驗觀察到小檗堿能夠抑制四株結直腸癌細胞的生長，將40 μmol小檗堿作用于LoVo細胞24 h后，進行細胞周期分析發現G2－M期的比例由10．5%上升到32．5%，細胞增殖停滯在 G2－M 階段，同時 cyclinB1、cdc2、cdc25c的量較對照組明顯升高，證明小檗堿通過調控細胞周期相關蛋白抑制增殖，但其具體機制仍不清楚。

小檗堿還通過抑制COX－2的轉錄抑制細胞增殖。吳柯等［32］通過MTT實驗觀察loVo細胞的增殖情況、RT－PCR法檢測COX－2的表達水平、Western blotting法檢測COX－2蛋白的表達水平，結果發現小檗堿在濃度＞10－5mol／L時可以顯著抑制 lovo細胞增殖，誘導凋亡，且呈濃度和時間依賴性，并能濃度依賴性地降低COX－2 mRNA和COX－2蛋白的表達，證明小檗堿通過抑制COX－2表達發揮抑制細胞增殖、誘導凋亡的作用。王邦茂等［33］也發現小檗堿可抑制DCA誘導的HT－29人結腸癌細胞增殖，抑制COX－2 mRNA和蛋白表達及PGE2合成，認為這一作用可能是小檗堿抑制HT－29細胞增殖的機制之一。Fukuda等［34］認為小檗堿作用于COX－2基因的啟動子，抑制COX－2基因的轉錄，從而降低PGE2的水平，濃度依賴性的抑制結腸癌DLD－1細胞的生長。

外源性促生長因子能夠調節細胞增殖過程，小檗堿通過干擾外源性促生長途徑抑制細胞增殖。Wang 等［35］觀察到未進行干預時 IMCE 和 HT－29 細胞中上皮生長因子受體 （epidemal growth factor receptor，EGFR）和其磷酸化水平明顯升高，腫瘤細胞中存在EGFR的過度表達和活化。小檗堿作用后不僅能顯著下調基礎表達的EGFR及其磷酸化物的量，還有效抑制了上皮生長因子（epidemal growth factor，EGF）誘導的EGFR的活化，同時實時定量PCR測定EGFR mRNA水平沒有明顯變化，證明小檗堿不是從基因表達水平調控EGFR含量的；又檢測到泛素連接酶Cb1磷酸化水平升高，免疫沉淀法測定磷酸化Cb1和EGFR的交聯物及EGFR的泛素化物含量升高。根據實驗結果，他們認為小檗堿能夠提高Cb1的磷酸化水平，從而增強其對EGFR的泛素化水平，最終導致EGFR的在細胞膜上的重組或降解破壞，外源促生長因子無法作用于結腸癌細胞，抑制細胞增殖。

4 抑制腫瘤細胞的擴散

研究已證實小檗堿通過作用于細胞內重要的信號通路從而抑制多種腫瘤細胞的侵襲，包括IKK、NF－κВ、ERK、AMP 等介導的信號通路。Ho等［36］通 過 劃 痕 實 驗 、Transwell 實 驗 觀 察 到 62．5 μmol、125 μmol小檗堿作用24、48 h后遷移、侵襲能力明顯 被 抑 制 ，MMP－2、MMP－9、u－PA、FAK、p－JNK、NF－κB的水平與對照組相比明顯下降，結合其他同類實驗結果，他們認為小檗堿通過FAK、p－JNK、NF－κB信號通路抑制在腫瘤轉移中發揮重要作用的 MMP－2、MMP－9、u－PA 的表達。Park 等［37］發現小檗堿作用于多株結腸癌細胞后誘導產生ROS，激活腺 苷 酸 活 化 蛋 白 激 酶 （AMP－activated protein kinase，AMPK）通路，通過AMPK依賴性途徑抑制整合素β1的翻譯，整合素β1蛋白水平下降，其下游分子Src、FAK、p130Cas磷酸化下降；小檗堿也能夠直接影響整合素β1的穩定性，導致蛋白降解，從而抑制其介導的腫瘤細胞黏附、遷徙、侵犯能力的下降。Kim等［38］通過黏附實驗、劃痕實驗、Transwell實驗觀察到小檗堿有效抑制腫瘤細胞的黏附、遷徙，也證實了ROS的產生激活了AMPK通路，并同時發現ERK活化水平和COX－2表達的下降，得出結論小檗堿通過活化AMPK通路抑制ERK信號通路和COX－2的表達，起到抑制腫瘤細胞黏附、遷徙和侵犯周圍組織的作用。小檗堿在體外實驗中也顯示了較好的抑制腫瘤擴散的作用。Mitani等［39］用小檗堿40 mg／kg灌胃腫瘤模型小鼠14 d后，發現淋巴結轉移明顯減少，小檗堿與抗癌藥物伊立替康共同作用后產生協同效應，較單獨作用組更顯著地抑制了腫瘤在原發部位的生長以及淋巴結的轉移。

Murthy等［40］研究還發現小檗堿能夠抑制腫瘤轉移過程中血管的形成，作用72 h后能夠顯著下調血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）且這一作用與 caspase－8的活化相關，又進一步測定與血管形成、caspase－8相關的TNF相關凋亡誘導受體（TNF－related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）、 凋亡誘導因子 （apoptosis inducing factor，AIF）、存活素（survivin），結果發現 TRAIL 沒有明顯變化，作用12 h后AIF、suivivin的水平上升，48 h后兩者含量均下降。

5 抑制結腸癌細胞的其他機制

5．1 小檗堿影響鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）的表達 ODC是腫瘤標志物多胺合成代謝途徑中的第一個限速酶，ODC活性的異常會引起包括腫瘤在內的一系列疾病的發生，研究發現腸黏膜細胞內高ODC活性和多胺含量是腸癌發生的主要因素［41］。王桂香等［42］的研究中熒光定量PCR 結果 顯 示 25、50、100 μmol／L 鹽 酸 小 檗 堿 對 ODC mRNA表達雖有下調趨勢，但差異無統計學意義，Western blotting結果表明鹽酸小檗堿可顯著下調ODC蛋白表達，且隨著藥物濃度的增加，表達逐漸降低，具有劑量依賴效應，表明小檗堿對ODC的影響可能是在翻譯水平上的調控。

5．2 小檗堿和化療藥物及放療的協同作用 小檗堿與化療藥物或放療共同作用于腫瘤細胞時，能夠產生協同作用，作用效果顯著強于單獨作用。研究發現AS2O3與鉑類藥物的化療方案中，加用小檗堿后能夠明顯提高對HeLa、SNU－5、膠質瘤細胞等多種腫瘤細胞的細胞毒作用［43］；Liu 等［44］將 ER 受體拮抗劑和小檗堿聯合用于ER受體陽性的乳腺癌細胞MCF－7的治療，發現能夠有效抑制細胞生長。此外放射線與小檗堿對 A549［45］、HepG2［46］等腫瘤細胞在細胞凋亡上也表現出抑制的協同作用。但目前協同作用的具體機制仍不清楚。

5．3 小檗堿參與細胞自噬 研究發現小檗堿在發揮細胞毒作用誘導腫瘤細胞死亡的過程中，不僅參與細胞凋亡還加速了細胞自噬。Peng等［45］通過小檗堿作用于肺癌細胞的研究發現，細胞出現了一系列自噬的特征性形態學改變，同時參與自噬過程的Beclin－1和Bcl－2分子的調控，從而證實小檗堿參與了細胞自噬過程。Wang等［47］的研究也發現小檗堿能夠提高腫瘤細胞中Beclin－1的表達，并且抑制mTOR對自噬過程的調控。由于細胞凋亡和自噬調節網絡的復雜性和交叉性，小檗堿對自噬過程的具體作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，可知植物有效成分已成為抗癌新藥開發的重要來源，小檗堿因其廣泛藥理活性有效抑制腫瘤細胞而成為研究熱點。未來其抗癌機制的研究將集中在基因水平，通過進一步探討小檗堿在細胞信號通路、細胞周期調控、凋亡誘導及抑制、腫瘤抑制物、mRNA等中的作用機制，確定抑癌精確靶點，并且確定針對不同惡性腫瘤的作用劑量，設計短期化療方案。目前對于小檗堿抑制惡性腫瘤的研究還主要集中在實驗室階段，缺乏臨床實驗證據和支持，將通過作用機制的進一步闡明，并結合臨床效果和反應，開發出高效低毒的新型化療藥物。

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