IL-33對大鼠I/R損傷心肌炎癥反應和細胞自噬的影響

馬瑞松，李元紅，江洪，胡笑容，李雪飛(武漢大學人民醫院，武漢430060;恩施土家族苗族自治州中心醫院)

IL-33對大鼠I/R損傷心肌炎癥反應和細胞自噬的影響

馬瑞松1，李元紅2，江洪1，胡笑容1，李雪飛1
(1武漢大學人民醫院，武漢430060;2恩施土家族苗族自治州中心醫院)

摘要:目的探討IL-33對心肌缺血再灌注(I/R)損傷心肌的保護作用及機制。方法將32只大鼠隨機分為假手術組(n=10)、模型組(n=10)、IL-33組(n=6)及IL-33特異性受體(ST2)抑制劑組(anti-ST2組，n=6)。除假手術組外，其余各組采用結扎冠狀動脈左前降支法建立I/R心肌損傷模型。假手術組僅麻醉、開胸、穿線，但不結扎。IL-33制模前30 min尾靜脈注射IL-33 10 μg，anti-ST2組注射anti-ST2 0.2 mL(1mg/mL)。再灌注4 h后取血清或心肌組織檢測各組以下指標:①血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)水平:采用分光光度法檢測;②心肌組織Th1型炎癥因子(TNF-α、INF-γ、IL-6)和Th2型炎癥因子(IL-4、IL-5、IL-13)水平:采用ELISA法檢測;③心肌組織自噬蛋白LC3和beclin-1相對表達量:采用Western blot法檢測。結果①LDH、CK水平:模型組均明顯高于假手術組，IL-33組均明顯低于模型組，P均＜0.05; anti-ST2組較模型組無統計學差異。②心肌組織炎癥因子表達: Th1型炎癥因子模型組及IL-33組均明顯高于假手術組，IL-33組明顯低于模型組，P均＜0.05; anti-ST2組與模型組比較無統計學差異。Th2型炎癥因子模型組明顯低于假手術組，IL-33組明顯高于模型組，anti-ST2組與模型組比較無統計學差異;③心肌組織自噬蛋白LC3和beclin-1相對表達量:模型組明顯高于、IL-33組明顯低于假手術組; IL-33組明顯低于模型組(P均＜0.05) ; anti-ST2組與模型組比較無統計學差異。IL-33與anti-ST2組各觀察指標均有統計學差異(P均＜0.05)。結論IL-33可通過抑制細胞過度自噬，減弱Th1型炎癥反應，促進Th2型炎癥反應而減輕心肌I/R損傷。

關鍵詞:心肌;缺血再灌注損傷;白介素33;細胞自噬;炎癥因子

研究證實，炎癥反應和細胞自噬在心肌缺血再灌注(I/R)損傷發生發展過程中發揮重要作用［1～4］。IL-33是一種IL-1家族細胞因子，存在于細胞核內，可調控細胞增殖和轉錄。當細胞凋亡和壞死時IL-33被釋放到細胞外，但凋亡細胞中活化的Caspase-3會將IL-33剪切為無生物活性的片段，而完整的IL-33與其特異性受體ST2結合可發揮細胞因子的作用。近期研究證實，IL-33可誘導幼稚型T細胞向Th2細胞分化，加強Th2型炎癥反應，減弱Th1型炎癥反應;可參與調節細胞自噬［5，6］。但IL-33是否可通過調節炎癥反應和細胞自噬影響心肌I/R損傷尚無相關報道。為此，我們于2014年10月～2015年1月進行了如下研究。

1　材料與方法

1.1動物分組與處理SPF級成年雄性SD大鼠32只，體質量200～250 g，購于武漢大學動物實驗中心。隨機分為假手術組(假手術組，n=10)、缺血再灌注組(模型組n=10)、白介素33組(n=6)、ST2抑制劑(anti-ST2)組(anti-ST2組，n=6)。除假手術組外，其余各組均建立心肌I/R損傷模型: 2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，氣管插管，連接動物呼吸機(呼吸頻率70次/min，吸呼比1︰1.5，潮氣量3～4 mL/100 g)。動物心電圖機記錄Ⅱ導心電圖。于胸骨左緣開胸暴露心室前壁，剪開心包膜;于左心耳與肺動脈圓錐間用小圓針帶5-0線穿過左前降支(LAD)下緣，將前降支與一個中間帶凹槽的空心乳膠管一起結扎。以心尖部心肌變蒼白、心電圖Ⅱ導聯明顯上抬表明缺血成功。缺血30 min，再灌注4 h。假手術組僅麻醉、開胸、穿線但不結扎。IL-33組及anti-ST2組分別于制模前(麻醉后)尾靜脈注射IL-33 10 μg、anti-ST2 0.2 mL(1 mg/mL)。

1.2檢測項目及方法

1.2.1血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)水平采用分光光度法。再灌4 h后各組經頸靜脈取血2 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，－80℃冰箱保存，選用南京建成生物工程研究所試劑盒，按照試劑盒說明書規范操作檢測血清LDH和CK。

1.2.2心肌組織Th1、Th2型炎癥反應因子表達再灌4 h后，取各組結扎線水平以下的心肌，剪除右心室，錫紙包被后－80℃冰箱凍存。制備心肌組織勻漿，選用南京建成生物工程研究所試劑盒，采用ELISA法按照試劑盒說明書規范操作，檢測心肌組織中Th1型炎癥反應因子(TNF-α、INF-γ和IL-6)和型炎癥反應Th2因子(IL-4、IL-5和IL-13)。結果(pg/mL)用標準曲線法算出。

1.2.3心肌組織自噬蛋白LC3、beclin-1表達采用Western blot法檢測。取材方法同1.2.2，檢測方法參照文獻［9］，根據分子質量配制12%PAGE膠，電泳后轉膜，用5%的脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗過夜，用LC3、beclin-1對應的HRP標記的二抗孵育后，ECL顯色。以β-actin為內參計算上述蛋白的相對表達量。

1.3統計學方法采用SPSS21.0統計軟件。數據以珋x±s表示。組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1血清LDH和CK各組血清LDH和CK水平見表1。由表1可見，與假手術組比較，模型組血清LDH和CK明顯升高(P均＜0.05) ; IL-33組血清CK明顯增高(P＜0.05)，LDH差異無統計學意義。與模型組比，IL-33組血清LDH和CK明顯降低(P均＜0.05)，anti-ST2組血清LDH和CK有增高趨勢，但差異無統計學意義。

2.2心肌組織Th1、Th2型炎癥因子表達各組鼠心肌組織Th1型炎癥因子TNF-α、INF-γ、IL-6和Th2型炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13見表2。由表2可見，與假手術組比較，模型組和IL-33組心肌組織TNF-α、INF-γ、IL-6水平明顯升高(P均＜0.05) ;與模型組比較，IL-33組心肌組織上述三種炎癥因子水平明顯降低(P均＜0.05)，anti-ST2組心肌組織上述三種炎癥因子表達有增高趨勢，但差異無統計學意義。與假手術組比較，模型組心肌組織IL-4、IL-5 和IL-13水平均降低(P均＜0.05) ;與模型組比較，IL-33組心肌組織IL-4、IL-5和IL-13水平均升高(P均＜0.05)，anti-ST2組心肌組織IL-4、IL-5和IL-13水平與模型組比較差異無統計學意義。

表1　各組血清LDH和CK水平比較(±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與IL-33組比較，ΔP＜0.05。

組別　n　LDH(U/L)　CK(U/L)假手術組10　857.988±91.148　1 587.000±179.836模型組　10　1 738.856±88.600*　4 194.760±206.029*IL-33組　6　991.716±11.655#　2 704.333±297.295* #anti-ST2組　6　1 809.073±48.105Δ　4 387.657±200.291Δ

表2　各組心肌組織Th1、Th2型炎癥因子水平比較(pg/mL，±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與IL-33組比較，ΔP＜0.05。

組別　n　Th1 Th2型炎癥因子IL-4　IL-5　IL-13假手術組　10　110.107±5.290　276.269±9.502　72.455±7.930　945.370±59.134　723.139±88.099　965.473±27型炎癥因子TNF-α　INF-γIL-6 3.834模型組　10　188.820±8.145*　438.230±8.343*　162.119±10.110*　247.720±37.803*　201.609±17.225*165.449±12.407*IL-33組　6　134.636±5.934#　328.496±9.549#　94.527±5.913#　476.320±26.295* #387.003±17.718* #312.966±53.514* #anti-ST2組　6　205.430±5.585Δ　453.681±8.851Δ　167.921±11.461Δ　315.277±31.615Δ　252.973±17.306Δ　179.636±27.056Δ

2.3心肌組織自噬蛋白LC3、beclin-1表達各組心肌組織自噬蛋白LC3、beclin-1水平見表3。由表3可見，與假手術組比較，模型組心肌組織中LC3和beclin-1水平明顯升高(P均＜0.05)，IL-33組心肌組織中LC3和beclin-1水平明顯降低(P均＜0.05)。與模型組比較，IL-33組心肌組織中LC3、beclin-1水平明顯降低(P均＜0.05)，anti-ST2組心肌組織中LC3、beclin-1水平與模型組比較差異無統計學意義。

表3　各組心肌組織自噬蛋白LC3、beclin-1表達比較(相對表達量，±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05;與IL-33組比較，ΔP＜0.05。

組別　n　LC3/β-actin　beclin-1/β-actin假手術組10　0.319±0.071　0.287±0.043模型組　10　0.409±0.075*　0.424±0.063*IL-33組　6　0.178±0.048* #　0.160±0.021* #anti-ST2組　6　0.545±0.096*Δ　0.496±0.071*Δ

3　討論

研究證實，IL-33可誘導幼稚T細胞分化為Th2型細胞，并可作為Th2細胞的趨化因子促進Th2細胞聚集;還可直接作用于Th2細胞，促進Th2型炎癥因子的分泌［7～9］。Li等［5］報道，IL-33可通過抑制Th1型炎癥反應(降低INF-γ)、誘導Th2型炎癥反應(升高IL-4、IL-5和IL-13)抑制肝臟I/R。Yin等［10］研究發現，IL-33可通過誘導Th2型炎癥反應明顯延長小鼠心臟移植后心臟的存活時間。本研究結果顯示，在心臟I/R過程中，IL-33可通過抑制Th1炎癥反應(降低TNF-α、INF-γ和IL-6)，誘導Th2炎癥反應(升高IL-4、IL-5和IL-13)達到降低血清LDH和CK水平、保護心肌的目的。這與前期的研究一致。近期有文獻報道，IL-33可促進Th1型免疫反應;亦可影響CD+8型抗病毒T細胞的發育［11］。但本研究中未發現IL-33可升高Th1相關炎癥因子水平，提示IL-33可能僅在抗腫瘤和抗慢性病毒性疾病時激活Th1型免疫反應［11］，而在心肌I/R中不能激活Th1型免疫反應。

近期大量的研究表明，細胞自噬在心肌I/R中起著非常重要的作用［6，12，13］。心肌I/R導致的ATP耗竭、氧化應激、內質網應激和蛋白降解均可導致心肌細胞自噬。但自噬對心肌I/R的利與弊取決于具體環境，適度激活自噬對心肌細胞有保護作用，但過度激活自噬會造成細胞死亡［12］。目前普遍認為，在缺血階段適度激活自噬可處理受損蛋白質，是一種細胞自我保護;在再灌注階段自噬過度激活可加重心肌I/R損傷［12，13］。Matsui等［14，15］的研究表明，心肌I/R階段自噬過度激活，表現為beclin-1表達升高，Bcl-2表達顯著下調，可導致細胞死亡。本研究模型組心肌組織LC3、beclin-1水平明顯高于假手術組，提示I/R損傷可導致心肌細胞過度自噬; IL-33組心肌組織LC3、beclin-1水平明顯低于模型組，提示IL-33可通過抑制I/R引起的心肌細胞過度自噬，保護心肌。ST2為IL-33特異性受體，anti-ST2可特異性阻斷內源性IL-33的作用。本研究結果顯示，anti-ST2組和模型組大鼠血清及心肌組織各指標差異均無統計學意義，這可能是內源性IL-33含量低所致。心肌中IL-33由血管內皮細胞及心肌成纖維細胞分泌，含量極低;同時在心肌I/R過程中心肌細胞損傷以凋亡為主，而完整的IL-33在細胞凋亡時，會被活化的Caspase-3剪切為無活性的片段，進一步降低IL-33水平，而極低的IL-33表達水平，不足以表現出心肌保護作用。

關于IL-33的具體作用機制，目前認為可能與Bcl-2和活性氧(ROS)有關。研究證實，饑餓刺激時，Bcl-2可調節beclin-1介導的細胞自噬［16］，ROS也參與調節beclin-1的表達，且抗氧化劑可以明顯減少beclin-1的表達［17］。此外，ROS還可通過抑制自噬相關基因4(Atg4)的活性，促進LC3脂質化和激發自噬［18］。IL-33可促進Bcl-2表達［19］，減少ROS生成［20］，而二者進一步調節再灌注階段LC3、beclin-1的表達。beclin-1是心肌缺血后再灌注階段調節自噬最重要的蛋白［14，15］。再灌注階段beclin-1高表達可過度激活自噬，造成細胞損傷;而通過siRNA轉染抑制beclin-1的表達可抑制過度自噬保護心肌［21，22］。故我們推測IL-33可通過調控Bcl-2 和ROS的表達調節LC3和beclin-1表達，抑制過度自噬，保護I/R心肌。但其具體機制仍需進一步研究證實。

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Effect of interleukin 33 on inflammation response and autophagy in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury

MA Rui-song1，LI Yuan-hong，JIANG Hong，HU Xiao-rong，LI Xue-fei
(1 Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of interleukin 33 (IL-33) on myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury and the mechanism.Methods Thirty-two rats were randomly divided into 4 groups: the control group (n=10)，I/R group (model group，n=10)，IL-33 group (n=6) and anti-ST2 group (n=6).In addition to the control group，the left anterior descending coronary artery ligation method was adopted to establish the myocardial I/R injury model in the other groups (the sham operation group only received anesthesia，open-chest and threading，but not ligation).Rats in the IL-33+ I/R group and anti-ST2+ I/R group were separately injected to the caudal vein with 10 μg IL-33 and 0.2 mL anti-ST2 (1 mg/mL) 30 min before modeling.After reperfusion for 4 h，we obtained the serum or myocardial tissues to detect the following indicators of each group: (1) the serum lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) level: using spectrophotometry，(2) Th1 inflammation factors in the myocardial tissues (TNF-α，INF-γ and IL-6) and Th2 inflammatory cytokines (IL-4，IL-5 and IL-3) : using the ELISA，(3) the relative expression of autophagy protein LC3 and beclin 1 in the myocardial tissues: using Western blotting.Results(1) LDH and CK level: the model group was significantly higher than the control group，IL-33 group was significantly lower than the model group (P＜0.05)，and no statistical difference was found between the anti-ST2 group and the model group.(2) the inflammation factor expression in thebook=2,ebook=464myocardial tissues: Th1 type inflammation factor expression: the model group and IL-33 group were significantly higher than the control group，IL-33 was significantly lower than the model group (all P＜0.05)，and no difference was found between the anti-ST2 group and the model group.Th2 type inflammation factor expression: the model group was significantly lower than the control group，IL-33 group was significantly higher than the model group，and no statistical difference was found between the anti-ST2 group and the model group.(3) The relative expression of autophagy protein LC3 and beclin-1 in the myocardial tissues: the model group was significantly higher，IL-33 group was significantly lower than the control group，IL-33 was significantly lower than the model group (all P＜0.05)，no significant difference was found between the anti-ST2 group and the model group.Statistically significant differences were found in all indexes between the IL-33 and anti-ST2 group.Conclusion IL-33 may attenuate myocardial I/R injury by inhibiting the excessive autophagy，weakening Th1 inflammatory response and enhancing Th2 inflammatory response.

Key words:Myocardium; ischemia-reperfusion injury; interleukin 33; autophagy; inflammatory factor

(收稿日期:2015-03-11)

通信作者簡介:李元紅(1956-)男，博士，主任醫師，教授，研究方向為心電生理和冠心病。E-mail: lyholol@ vip.163.com

作者簡介:第一馬瑞松(1988-)，碩士在讀，研究方向為冠心病。E-mail: maruisong@ outlook.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81370308)。

文章編號:1002-266X(2015)22-0001-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R543.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.001