明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料的構建及其生物相容性檢測

秦麗娜(中山大學中山醫學院，廣州 510080)

·論著·

明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料的構建及其生物相容性檢測

秦麗娜(中山大學中山醫學院，廣州 510080)

摘要：目的構建明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料，并檢測其生物相容性。方法混合明膠、殼聚糖溶液后加入微量神經營養素3，將混濁液注模成型后冷淋干燥制備明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料，利用掃描電子顯微鏡觀察支架材料形態，液體代替法測算孔隙率。提取明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料浸提液，觀察其對神經干細胞活性的影響及對全反式維甲酸預誘導的神經干細胞分化的影響，并采用膜片鉗技術檢測誘導分化前后細胞的電生理特性。結果明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料內徑為(267.0±13.8)μm，孔隙率為90.0%。神經干細胞在支架材料上生長良好，在全反式維甲酸誘導下形態向神經元樣細胞改變，并初步表現出神經元間突觸連接的結構，且誘導分化的神經元樣細胞初步具備神經元細胞的電生理特性。結論成功構建了明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料，其與神經干細胞之間的生物相容性良好。

關鍵詞：脊髓損傷；支架材料；神經營養素3；維甲酸；神經干細胞

脊髓損傷常導致偏癱、截癱，其修復仍然是全球性醫學難題。在脊髓損傷的過程中，除機械損傷外，還包含局部微環境的損傷，主要包括細胞和組織的丟失、繼發的缺血缺氧、自由基生成等不利于修復的因素。研究人員以組織工程學為基礎，緊緊圍繞種子細胞、細胞因子、組織工程支架這3個要素[1]，進行了大量脊髓損傷修復的實驗研究，并取得了一些較好的效果[2,3]。本實驗采用明膠、殼聚糖為原料，并復合神經營養素3，制備神經支架，觀察其對全反式維甲酸預誘導的神經干細胞分化的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料及制備明膠(生物級)、神經營養素3試劑購自天津市科密歐化學試劑有限公司；殼聚糖(脫乙酰度95%)購自美國Sigma公司；冰醋酸、NaOH、碳酸鉀、NaCl均為市售分析純。人工腦脊液成分：2 mmol/L CaCl2、1.25 mmol/L NaH2PO4、125 mmol/L NaCl、25 mmol/L NaHCO3、2.5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2和25 mmol/L葡萄糖(pH 7.4)。電極內液成分:120 mmol/L葡萄糖酸鉀、10 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L EGTA和20 mmol/L KCl(pH 7.2)。對于收集動作電位、自發興奮性突觸后電位的電極內液成分:0.5 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、135 mmol/L葡萄糖酸鉀、5 mmol/L HEPES、5 mmol/L KCl、5 mmol/L EGTA、5 mmol/L Na2ATP。灌流液成分:25 mmol/L NaHCO3、1.2 mmol/L MgCl2、3.6 mmol/L KCl、117 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、1.2 mmol/L NaH2PO4和11 mmol/L葡萄糖(pH 7.4,利用NaOH調整)。

1.2明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料的構建將明膠溶于去離子水，40 ℃水浴加熱，配成10%明膠溶液；將殼聚糖溶于2%的醋酸溶液中制備成2%的殼聚糖溶液。將明膠∶殼聚糖兩種溶液按質量分數4∶6的比例混合[4]。然后再次放入40 ℃水浴中攪拌混勻，同時加入微量神經營養素3，采用超聲分散，磁力攪拌法攪拌均勻，靜置24 h。將制備成功的懸濁液緩慢注入內徑為250 μm、外徑為280 μm、長200 mm的硅膠套管中，鉛絲密封兩端。采用冷淋技術，將注模成功的樣品緩慢浸入深低溫冷淋劑(液氮)中，完全浸入液面后保留30～60 min，放入-80 ℃冰箱中保留30～60 min，使混懸液中沉淀物周圍形成連續、相互溝通的溶劑冰晶網架構。將制備成功的200 mm長明膠—殼聚糖復合神經營養素3懸濁液的硅膠管冷凍體，精確切成30 mm短節段，放置于預冷好的鋁彎盤中，置入Alphal-2型冷凍干燥機，在-60 ℃、100 mtorr下冷凍干燥24 h。支架中的溶劑冰晶升華后得到具有微孔結構的支架架構。真空狀態下升溫至0 ℃并維持6 h，繼續升溫至22 ℃維持30～60 min，解除真空后升至常溫，得到干燥成形的明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料。

1.3明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料形態觀察和孔隙率測量隨機抽取20根明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料，利用常規方法對神經支架材料噴金鍍膜，采用掃描電子顯微鏡觀察支架材料的形態。采用目前較為常用的液體代替法測算孔隙率。使用75%乙醇溶液為替換液體，將神經支架材料(干重W)放入可密封容器中，浸入乙醇(體積V1)，使用負壓抽吸支架材料內氣體，直至無氣泡逸出。測量乙醇及乙醇—神經支架總體積V2。緩慢取出支架，測量剩余乙醇(體積V3)。計算公式：孔隙率=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。其中V1-V3為神經支架中乙醇體積，V2-V3為神經支架本身體積。

1.4明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料的生物相容性檢測①明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料浸提液的制備：取神經支架材料100 mg置于20 mL離心管中，將其與3 mL細胞培養液混合，置于37 ℃恒溫振蕩培養箱(100 r/min)24 h后，提取浸提液，加入α-MEM培養液，混合比例為1∶9，震蕩搖勻。全部過程需無菌操作。②神經干細胞的分離培養：參照既往培養神經干細胞方法的實驗研究[5]，在無菌超凈臺下，選新生1～2 d純種SD乳鼠3只，取大腦皮質，PBS反復沖洗后，將組織放入DMEM/F12混合液中浸泡漂洗。濾網取出組織塊后得到細胞懸液。調整細胞濃度為1×108個/mL，同時向DMEM/F12培養液中添加B27、表皮生長因子(EGF)及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，三者濃度均為20 ng/mL，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養2 d后換液。7 d后將細胞移入離心管，100 r/min離心，5 min后，0.25%胰蛋白酶消化3 min，使用含N2的DMEM-F12細胞培養液吹打重懸后進行常規培養。每3 d換液1次，每7～10 d傳代1次。③神經干細胞活性檢測：將第3代神經干細胞以5×107/L的濃度移入24孔培養板，設實驗組和對照組，實驗組加支架材料浸提液0.2 mL，對照組加含體積分數10%胎牛血清的培養液0.2 mL，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。每2 d進行1次半量換液，培養14 d。采用MTT法檢測神經干細胞活性[6,7]，通過酶聯免疫檢測儀，在570 nm波長的條件下，測定兩組細胞第1、5、10、14天的吸光度。④全反式維甲酸預誘導前后神經干細胞形態觀察：將支架材料按照12孔培養板大小剪成圓片狀置于12孔培養板中，與濃度為1×107/L的第3代神經干細胞在37 ℃、5%CO2、飽和濕度下共培養。在共培養前，將EGF、bFGF從神經干細胞培養液中去除，同時移入全反式維甲酸和胎牛血清，維甲酸濃度為1 μmol/mL，胎牛血清體積分數為5%，培養14 d。觀察初始分離神經干細胞、去除EGF、bFGF培養的細胞及支架材料浸提液與全反式維甲酸預誘導的神經干細胞的細胞形態。⑤誘導分化前后神經干細胞的電生理特性檢測：分別選取第3代誘導分化前神經干細胞和④中經全反式維甲酸誘導分化后的神經干細胞。采用Sutter P-97水平拉制儀制作微電極。本實驗使用微電極尖端直徑為2.5～3.0 μm，阻抗為2～3 MΩ。采用倒置相差顯微鏡和液壓操縱儀進行顯微膜片鉗細胞操作。先將兩種待檢測的細胞用人工腦脊液灌流，在灌流前，利用95%O2/5%CO2混合氣體對人工腦脊液預先飽和1 h，然后使用電子刺激器產生脈沖電流，通過MEZ-8201微電極放大器向細胞內注入恒定的脈沖電流，利用膜片鉗描筆記錄儀同時記錄靜息電位和膜電位。對待檢測細胞進行0.6～1.0 nA,310 ms的去極化電流胞內注射，用來誘發動作電位；利用微電極將待測細胞膜電位鉗制于-70 mV，用來誘發并記錄細胞自發的興奮性突觸后電流。利用膜片鉗電位記錄儀器通過相關軟件收集處理數據。

2結果

2.1明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料形態及孔隙率神經支架材料呈長管狀，可根據需要自行調整長度，具有高度仿真性，神經支架材料的橫切面上可見材料呈現出多孔結構，縱切面上可見材料內部呈軸向微管結構，相鄰的微管之間未見孔隙相互連接(插頁Ⅰ圖1)，內徑261～293(267.0±13.8)μm，孔隙率為84.1%～93.0%、平均90.0%。

2.2明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料的生物相容性初始分離神經干細胞的形態多成圓球狀，培養2～3 d后，形成由多個細胞組成的細胞團，細胞團形態不規則，但細胞大小一致，細胞團折光性好。經過傳代后，細胞團增大，且形態較為規則。對細胞進行去除EGF及bFGF的培養可發現，細胞貼壁生長，形態不一，出現多個突起。支架材料浸提液與神經干細胞共培養14 d后，神經干細胞出現類似神經細胞的形態改變，胞體呈多角形以及不規則形，有多個突起，呈現出神經元樣細胞的表現(插頁Ⅰ圖2)。實驗組、對照組第1天的吸光度值分別為0.29±0.06、0.30±0.04，第5天分別為0.39±0.09、0.40±0.03，第10天分別為0.69±0.05、0.58±0.06，第14天分別為0.87±0.07、0.64±0.07，兩組第10、14天時比較，P均<0.05。兩組細胞的吸光度值隨培養時間的延長而增大。支架材料浸提液與全反式維甲酸預誘導的神經干細胞共培養14 d后，支架材料的表面及空隙內可見較多細胞生長，細胞胞體發出多個突起，胞體呈多角形以及不規則形，有多個突起，突起相互連接，使細胞交織成網狀，表現出類神經元樣細胞的改變，支架材料對細胞無明顯生物學影響，在全反式維甲酸誘導下可促進神經干細胞向類神經元細胞分化，具有良好的細胞相容性。神經干細胞誘導分化前、后靜息電位分別為(-28.99±5.08)、(-57.88±7.09)mV，膜電位分別為(18.09±1.09)、(36.80±5.03)pF，誘導分化前、后比較，P均<0.01。詳見圖1、2。

注：左上圖示誘導分化成神經元樣細胞產生的動作電位；右上圖示神經干細胞不產生動作電位；下圖示神經元樣細胞鉗制在-40 mV時去極化,產生大量的動作電位。

圖1細胞的動作電位

注：a、b線示神經干細胞無自發的興奮性突觸后電流；c、d線示誘導分化成神經元樣細胞會產生自發的興奮性突觸后電流，但與正常的神經元相比，其電流頻率低、幅度稍??；e、f線示典型神經元的自發的興奮性突觸后電流,電流頻率高、幅度大。

圖2膜片鉗記錄的細胞的興奮性突觸后電位

3討論

目前，脊髓損傷缺乏良好治療方法。中國每年有大量因事故導致的脊髓損傷患者，且以胸腰段脊髓損傷為主[6],組織工程學研究為解決這一問題提供了新思路。研究人員從工程支架材料入手，研究了一系列適合制作支架的材料[7,8]，如水凝膠、聚丙烯等。明膠和殼聚糖也是其中研究較為深入的兩種材料[9～10]，兩者來源廣泛，價格低廉，具有較好的生物相容性，殼聚糖可降解，還具有抗菌防腐和成膜性的特性。本實驗選用傳統的冷淋技術，將兩種材料的混合液處理后，制得的材料在掃描電鏡成像中顯示，材料的縱切面呈現長微管狀，微管之間彼此不相連，這為將來神經元軸突以及突起相互連接提供了良好的結構基礎，且不易使神經元橫向生長，抑制了瘢痕組織橫向愈合，提供了天然的結構屏蔽作用。測量支架材料的孔隙率結果顯示，種子細胞可以大量“居住”在支架材料的天然空隙中，這為有效發揮種子細胞的修復作用提供了客觀的可能。此外，為有效修復損傷的脊髓，研究人員將神經營養因子以及干細胞復合到支架材料上，使一個載體搭載多種修復機制，最大限度發揮組織工程材料的優勢。其中神經營養素3被發現具有較好的營養細胞、促進神經元存活、維持其活性的作用，并可有效促使軸突延伸并再生[11]。此為支架材料有效發揮復合的神經營養素3的作用，提供了可靠的實驗依據。

在干細胞研究方面，研究較多的有神經干細胞、骨髓間充質干細胞等[12～14],本實驗選用神經干細胞，其在全反式維甲酸誘導下容易向神經元樣細胞分化[15]。維甲酸具有較強的誘導性能，并在胚胎發育以及維持機體正常功能方面發揮重要作用[16]。本實驗按照既往的實驗方法獲得神經干細胞，并在全反式維甲酸的誘導下與支架材料浸提液及共培養后發現，支架材料本身對神經干細胞無生物學影響，且隨著時間的推移，能夠有效維持并加強干細胞的活性；在維甲酸的誘導下，神經干細胞能夠向神經元樣細胞分化，并分別從細胞形態以及細胞電生理特性得到證實。在細胞形態上，發現經過誘導分化后的神經干細胞具有類神經元的形態改變。電生理檢測中發現，神經干細胞和經過全反式維甲酸誘導分化后的神經元樣細胞，兩者的膜電位和靜息電位出現顯著差別，后者更加接近成熟的神經元細胞的電生理特征[17]，與既往其他研究結果一致，從電生理方面證實了本實驗誘導分化的有效性。神經元樣細胞被誘導出動作電位,而未誘導分化的神經干細胞不能誘發動作電位,這進一步證實了神經元樣細胞具有與神經元類似的活性。此外，神經元樣細胞上發現自發的興奮性突觸后電位，與成熟的神經元表現相似，但兩者頻率和幅度有一定的差別。

綜上所述，本研究成功構建了明膠—殼聚糖復合神經營養素3神經支架材料，其與神經干細胞之間的生物相容性良好，這為未來利用組織工程復合神經營養因子、種子細胞，進而治療脊髓損傷奠定了較好的基礎。

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Establishment of gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffold and its biocompatibility

QINLi-na

(ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Abstract:ObjectiveTo fabricate the gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffolds and to determine its biocompatibility. MethodsWe mixed the gelatin and chitosan solutions, then added a trace of neurotrophin-3. After making the injection mold, we fabricated the nerve guidance scaffolds by the freeze-drying technique. Then the characteristics of the scaffold were observed by scanning electron microscope morphology, and the scaffold diameter, porosity, etc were detected. We extracted the gelatin chitosan composite neurotrophin-3 nerve scaffold material extracts, and then we observed the effects on the growth and differentiation of neural stem cells; the electrophysiological properties of the differentiated cells were observed by the patch-clamp technique. ResultsThe inside diameter of gelatin-chitosan composite neurotrophins-3 nerve scaffold was (267.0±13.8) μm and porosity was 90.0%. Scanning electron microscopy showed that neural stem cells grew well on the scaffold. Under the induction of retinoic acid, neural stem cells differentiated into neuron-like cells, and showed structural of synaptic connections between neurons initially. What′s more, the cells differentiated were detected the neuron-like cell electrophysiological properties by the patch-clamp technique. Conclusion The gelatin-chitosan composite neurotrophin-3 nerve scaffolds were successfully constructed, and had good biocompatibility with neural stem cells.

Key words:spinal cord injuries; scaffold materials; neurotrophin-3; retinoic acid; neural stem cells

(收稿日期：2014-11-12)

作者簡介：秦麗娜(1978-)，女，博士，講師，主要研究方向為干細胞治療神經損傷。E-mail:qinglina20088@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31200737)；廣東省醫學科研基金立項課題(B2012080)。

中圖分類號：R318

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)07-0001-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.07.001