抑制白細胞介素-17活性短肽疫苗對ApoE-/-小鼠免疫功能的影響

抑制白細胞介素-17活性短肽疫苗對ApoE-/-小鼠免疫功能的影響

王順

(湖北省武漢市第一醫院, 湖北 武漢, 430022)

關鍵詞:抑制IL-17活性短肽疫苗; ApoE-/-小鼠; 安全劑量; 免疫功能

白細胞介素17(IL-17)是近年來發現的又一新的細胞因子[1]，它主要由活化的T淋巴細胞產生, 能誘導多種基質細胞產生多種前炎性細胞因子和造血活性因子, 如白細胞介素-6(IL- 6),白細胞介素-8(IL-8), 粒細胞集落刺激因子(GCSF),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1), 前列腺素E2(PGE2)等[2-3]。IL-17可通過促進炎癥反應造成組織損害，如在關節炎、多發性硬化癥(MS)/EAE、銀屑病、腸炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)等多種自身免疫性疾病[4-5]中發揮關鍵作用。IL-17 亦參與調節粒細胞生成(通過誘導G-CSF表達)[6-9]及宿主防御反應。有研究[10-11]表明，冠心病患者和AS小鼠體內存在Th17細胞功能亢進。本課題組前期用4個IL-17的肽段偶聯后獲得疫苗免疫新西蘭兔，篩選出能產生高滴度抗體且該抗體對IL-17活性抑制率高的肽段(0002)。本實驗通過ApoE-/-小鼠實驗研究該疫苗的安全有效使用劑量及對ApoE-/-小鼠免疫功能的影響，現報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物和試劑

SPF級ApoE-/-小鼠，購自Jackson試驗室(Bar Harbor, Maine, 美國)，由北京大學實驗動物中心繁殖。50 mmol/L Na2CO3(pH 9.6), 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)或10 mmol/L PBS(pH 7.2), 0.02%～0.05% Tween-20的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液或者Tris鹽緩沖液(pH 7.4)。

1.2IL-17活性的短肽疫苗制備

通過文獻閱讀分析出IL-17的功能位點，用DNAStar分析IL-17的氨基酸序列的親水性、抗原性及二級結構的特點，設計4條肽段，并通過前期實驗篩選出了能產生高滴度抗體且該抗體對IL-17活性抑制率高的肽段。

1.3IL-17活性的短肽疫苗小鼠毒性試驗

選取8周齡健康雄性ApoE-/-小鼠分為12組，每組5只，分別以5、10、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200 μg/只的劑量行腹腔注射IL-17活性的短肽疫苗。觀察1周內動物健康狀態、有無異常反應、中毒癥狀及死亡情況。

1.4IL-17活性的短肽疫苗對小鼠血清特異性抗體的影響

選取8周齡健康雄性ApoE-/-小鼠20只，分為試驗組和對照組。試驗組注射IL-17活性的短肽疫苗，劑量0.1 mL; 對照組注射生理鹽水，劑量0.1 mL。于0、2、4、6周共免疫4次，并分別對ApoE-/-小鼠進行剪尾取血，分離血清于-80 ℃保存備用。小鼠血清中特異性抗體效價測定：利用間接ELISA方法測定小鼠血滴中特異性抗體的效價。以IL-17作為捕獲抗原溶于包被液(0.5 mg/mL, pH 9.6碳酸鹽緩沖液)中，并在ELISA板上每孔加人100 μL, 于4 ℃保存過夜。次日用洗滌緩沖液PBS-Tween 20洗滌3次，甩干。將封閉液以每孔200 μL的量加入，于37 ℃封閉90 min同樣用PBS-Tween 20洗滌3次。將各待檢血清稀釋200倍，每孔中加入100 μL, 同時以未免疫的小鼠血清為陰性對照，以前期實驗分離純化的抗IL-17抗體為陽性對照。于37 ℃孵育90 min后，按上述同樣方法洗滌3次。每個孔中加100 μL二抗, 37 ℃孵育90 min后，再次洗板3次。隨后每孔加入100 μL的TMB, 37 ℃下顯色30 min, 最后加入50 μL(2 mol/L)的H2SO4終止反應。并于405 nm下測定其OD值，當(OD待檢樣品-OD空白對照)/(OD陰性對照-OD空白對照)≥2時判定為陽性。以陽性對照樣品進行ELISA測定的效價建立OD值與ELISA滴定效價的函數關系來計算抗體效價。

2結果

2.1IL-17活性的短肽疫苗體內毒性試驗及安全劑量

在給ApoE-/-小鼠注射了IL-17疫苗時發現，劑量為5、10、15、20、25 μg/只時，ApoE-/-小鼠無任何異常癥狀，為安全劑量；當劑量為30、40、50、60、80 μg/只時，ApoE-/-小鼠開始出現精神萎靡、行動遲緩等不良癥狀，但沒有死亡；當劑量為100、200 μg/只時, ApoE-/-小鼠出現了明顯的不良癥狀，開始死亡。

2.2IL-17疫苗對ApoE-/-小鼠血清特異性抗體效價的影響

IL-17疫苗免疫后，ApoE-/-小鼠血清中特異性抗體效價(1og2)發生變化。在免疫2周時，試驗組和對照組免疫后的平均效價都無顯著變化(P>0.05)。在免疫后的第6周，試驗組抗體效價平均為10.3, 顯著高于同期對照組(P<0.05), 說明IL-17疫苗在ApoE-/-小鼠休內能到達免疫效果。

3討論

動脈粥樣硬化(AS)是一種嚴重危害人類健康的疾病，與其相關的冠心病是全世界范圍的重要死因。近年來研究表明，動脈粥樣硬化是一種與免疫有關的慢性炎癥反應性疾病，由效應性T細胞功能異常介導的免疫炎癥反應，在動脈粥樣硬化的形成和斑塊的破裂中發揮了重要的促進作用，斑塊內炎癥細胞及其炎癥產物對粥樣斑塊脂質中心的擴大、纖維組織完整性的破壞及細胞外基質的不斷降解均有重要作用。冠狀動脈壁的炎癥反應參與了動脈粥樣硬化和血栓的形成過程，在血管的收縮、舒張、痙攣和血栓形成等過程中發揮極其重要的作用，但觸發炎癥反應的原因尚未明確。IL-17是近年來備受關注的一種細胞因子，它主要由活化的T淋巴細胞產生, 能誘導多種基質細胞產生多種前炎性細胞因子和造血活性因子, 如IL- 6、IL- 8、GCSF、TNF、IL- 1、PGE2等，同時IL-l7可促進細胞分泌多種細胞因子，并與TNF-α及IL-1等細胞因子有著復雜的聯系[12], 在多種疾病的發生和發展中處于關鍵地位。IL-17和其特異性受體同樣在動脈粥樣硬化中發揮著重要作用，IL-17可通過激活巨噬細胞分泌單核細胞趨化蛋白，使單核細胞聚集并進入血管內皮下，同時還促進巨噬細胞表面LDL受體的合成及巨噬細胞對LDL的攝取，促進粥樣斑塊形成。IL-17還可調節黏附分子和Thl細胞，促進TNF-α的表達，進而促進炎癥反應。在動脈粥樣硬化發生過程中，血管內皮的損傷可引起TNF-α的大量釋放，而TNF-α又可促進IL-17的釋放，二者通過協同作用造成血管內皮下免疫復合物沉積，進而形成血栓。IL-17還通過與TNF-α的協同作用，作用于微環境導致冠狀動脈粥樣硬化，從而促進冠心病的進展。IL-17尚可通過MAP激酶途徑和NF-kB-DNA途徑介導全身的炎癥反應。目前研究[13]認為, IL-17通過血管壁上IL-17受體上調產生動脈粥樣硬化損害并引起系統炎癥，IL-17水平升高還可通過激活巨噬細胞系統引起動脈損害進一步加重。有研究結果顯示，有動脈粥樣硬斑塊形成的ApeE(-/-)小鼠動脈血管壁的IL-17水平與對照組比較有明顯升高, Th17細胞增加的比例與斑塊的大小成正相關，并且發現可以用中和性抗IL-17Ab阻止其斑塊的發展。將抗中和性抗IL-17 Ab輸入小鼠體內，實驗結束時發現小鼠動脈斑塊面積、最大狹窄、平均狹窄程度均較對照組有明顯下降；斑塊較穩定，纖維帽增厚，膠原及平滑細胞增加。研究者在體外用IL-17刺激平滑肌細胞、巨噬細胞、內皮細胞及DC，發現其炎性反應加重。同時有研究[14]表明, IL-l7抗體、IL-17R、IgG1Fc融合蛋白、IL-17特異性可溶性受體或特異性抑制劑及IL-17R的單抗可不同程度地阻斷IL-17的部分效應。已有研究[15]表明，用IL-17抗體中和IL-17后, RA經典動物模型—膠原誘導的關節炎(CIA)小鼠早期關節炎癥減輕或消失，晚期CIA小鼠的骨損傷能夠有一定程度的恢復。因此, IL-l7疫苗在IL-17相關疾病治療中展示出了良好的前景。

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收稿日期:2014-11-18

中圖分類號:R 392

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)03-126-02

DOI:10.7619/jcmp.201503041