血液miRNA檢測在結直腸癌診斷、預后及化療療效評估中的應用進展

馮君蘭，汪昱

(上海交通大學附屬第六人民醫院，上海200233)

結直腸癌(CRC)是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，在西方發達國家其發病率居于惡性腫瘤的第2位，在我國其發病率和病死率均呈逐年上升的趨勢［1］。提高CRC的生存率，其根本和關鍵在于早期診斷、預后判斷及治療監測［2］。目前，CRC的檢測方法主要依靠內鏡活檢形態學病理檢查和胃腸造影的影像學檢查;而腫瘤患者出現影像學改變時大多已處于中晚期，且影像學對腫瘤病灶檢出率較低;病理學檢查為創傷性檢查，必需經腔內取材后才能獲得，而且臨床常見有癥狀才來就診。生化檢查只需取患者少量體液或標本，且具有無創、簡便及經濟等優點，患者依從性好，易于實施，是大規模人群篩查的理想手段，但目前尚無理想的指標可供參考。微小RNA(miRNA)是繼基因計劃后近幾年形成的生命科學的研究熱點，其不僅僅存在于腫瘤組織中，還穩定存在于血液中，通過參與多種信號通路調控CRC的發生、發展［3］?，F將血液中miRNA檢測在CRC早期診斷、預后監測、化療療效評估中的應用進展綜述如下。

1 miRNA的生物合成及作用機制

miRNA常簇生于蛋白編碼基因的內含子中，其在體內的形成源于RNA聚合酶的轉錄產生1 000 bp左右的初級產物(pri-miRNA)，后者進一步在細胞核內被RNaseⅢ內切酶家族的Drosha酶剪切成70 bp左右的發夾式前體pre-miRNA，在Ran-GTP依賴的Exportin-5蛋白的作用下從核內運輸到胞質中，后在Dicer酶的作用下，miRNA前體被剪切成21～25個核苷酸長度的單鏈miRNA，并結合到RNA誘導的基因沉默復合物(RISC)中，形成非對稱RISC復合物，與靶mRNA3'端非翻譯區(3'UTR)完全或不完全匹配結合，誘導靶mRNA降解或阻遏其翻譯，從而在轉錄后水平沉默基因的表達，并通過細胞內復雜的調控網絡對細胞代謝、分化、增殖與凋亡等進行調控［4］。因此，成熟miRNA的最終效應是通過阻止靶點蛋白的生成而下調其靶基因表達，一旦miRNA的表達水平失調，可導致包括腫瘤在內的多種疾病發生［5，6］。

2 血液miRNA檢測在CRC早期診斷中的應用

最近研究顯示，miRNA受內源性核糖核酸酶的保護，可以非常穩定地存在于人類血液中，尤其是惡性腫瘤患者的血清中，其表達水平足以供臨床檢測應用，從而為miRNA在腫瘤患者早期診斷中的應用提供了可行性［7］。Toiyama 等［8］發現，血清 miR-21表達水平可明確鑒別腺瘤及CRC，其AUC曲線下面積分別為 0.813(95%CI=0.691 ～0.910)和 0.919(95%CI=0.867 ～0.958);并且血清中 miR-21 的高表達與腫瘤體積、遠處轉移密切相關，并且患者的預后較差。Huang等［9］對120例CRC、37例晚期腺瘤患者及57例健康志愿者血清中12個miRNA(miR-134、miR-146a、miR-17-3p、miR-181d、miR-191、miR-221、miR-222、miR-223、miR-25、miR-29a、miR-320a、miR-92a)表達水平進行了檢測，結果顯示血清miR-29a、miR-92a可作為血清生物標志物聯合應用于CRC患者的早期診斷。并且Wang等［10］也發現，血清miR-29a表達升高與較晚的腫瘤分期相關，鑒別轉移與非轉移CRC患者的敏感度和特異度均達到75%，較血清癌胚抗原更為敏感(敏感度和特異度分別為60%、34%)。此外，Ng等［11］利用 CRC 患者和健康對照組篩選發現了5個差異表達的miRNA(miR-135b、miR-95、miR-17-3p、miR-92、miR-222)在血清和組織中均出現高表達，進一步在25例CRC患者和20例健康對照者血清驗證，結果發現CRC患者中miR-17-3p和miR-92表達顯著增加，而在10例CRC術后患者血清中的表達顯著降低;同時，miR-92的不同表達水平可用于鑒別CRC患者與胃癌患者、炎癥性腸病患者和正常受試者，miR-92的AUC曲線下面積為88.5%，在臨界值為240時，miR-92用于區分CRC和對照組的敏感性、特異性分別為89%、70%。目前，更多的血清miRNA相關的篩選研究已在CRC血清中鑒定出超過100種miRNA分子，其可作為CRC早期診斷的候選生物標志物。這些研究表明，血液中異常表達的miRNA有望在今后的臨床檢測中作為一種非侵入性的生物標志物應用于CRC的早期篩查和早期診斷。然而，腫瘤特異性miRNA的重疊性和差異性表達表明單個miRNA診斷CRC的敏感性和特異性較低，若能針對年齡相匹配的正常人、有早期病變的患者及不同階段CRC患者建立一組外周循環血中miRNA的差異表達譜，即有望實現對早期病變和不同階段CRC患者的早期診斷與精確評估。

3 血液miRNA檢測在CRC預后判斷中的應用

目前，多項研究已經證實了臨床上檢測CRC患者血液中miRNA表達譜的變化可用于對CRC患者的預后監測。血清miR-21目前被認為是適用于不同種族、不同地域CRC患者強有力的預后生物標志物［12～14］;研究［15］表明，血清高表達的 miR-21 可應用于Ⅱ期CRC患者的預后評估，即可在CRC早期階段識別高風險患者的疾病進展。Toiyama等［16］首先利用12例CRC患者血清樣本分析4個miR-200家族的 miRNA(miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429)，發現miR-200c與CRC的遠處轉移密切相關;后利用182例CRC患者及24例健康正常對照的血清進行驗證分析 miR-200c表達水平，結果發現miR-200c在Ⅳ期CRC患者中的表達水平明顯高于Ⅰ～Ⅲ期CRC患者，并且高表達的miR-200c與淋巴結轉移、遠處轉移、預后密切相關(P均＜0.05);更為重要的是，血清miR-200c可作為獨立的預后指標應用于CRC的淋巴結轉移(HR=4.81;95%CI=1.98 ～ 11.7，P=0.0005)、腫瘤復發(HR=4.51;95%CI=1.56 ～13.01，P=0.005)及 CRC 患者預后(HR=2.67;95%CI=1.28 ～5.67，P=0.01)的監測。Cheng等［17］利用102例CRC患者的血漿標本檢測miR-141的表達水平，結合CRC患者的臨床病理特征進行分析，結果發現miR-141的表達水平與CRC的TNM分期密切相關，可作為轉移性CRC的生物標志物;若聯合臨床常用的腫瘤標志物癌胚抗原，可提高對Ⅳ期CRC患者預后判斷的敏感性和特異性;為了進一步提高證實此研究結果，再次利用156例CRC患者的血漿樣本檢測miR-141的表達水平，通過對2個隊列的分析，證實了miR-141可作為晚期CRC患者的獨立預后因素。Pu等［18］發現，CRC患者血清miR-221的高表達預示著CRC患者的生存期較短，預后較差;并且血清miR-221水平與p53基因的表達存在顯著相關性，Kaplan-Meier曲線分析證實了miR-221可作為CRC患者獨立預后因素應用于臨床檢測。目前這些研究均表明，CRC患者血清中特征性miRNA的差異表達可作為CRC患者預后評估的潛在生物標志物應用于臨床。

4 血液miRNA檢測在CRC化療療效評估中的應用

對于CRC患者來說，只進行手術切除是遠遠不夠的，為了有效地治療和控制疾病，應接受相應輔助化療，以達到治療效果。因此，化療是治療CRC的主要方法之一，近年來有關miRNA與CRC化療關系的研究已逐漸成為關注的熱點。目前，更多的研究集中在從CRC組織中研究差異miRNA在化療耐藥中的關鍵分子機制，較少的研究關注血清中miRNA是否應用于判斷CRC患者的化療敏感性。Zhang等［19］利用 miRNA表達譜芯片篩選 253例CRC血清樣本與正常對照中的差異表達miRNA，并通過RT-PCR進一步驗證分析，結果發現了5個特征性的血清 miRNA(miR-20a、miR-130、miR-145、miR-216、miR-372)可聯合應用于預測CRC患者對化療的敏感性，在兩組CRC臨床血清樣本中ROC曲線下面積分別為 0.841、0.918。另外，Chen 等［20］首先利用表達譜芯片篩選出了5個CRC血清中差異表達的 miRNA(miR-221、miR-222、miR-122、miR-19a、miR-144)，進一步在72例臨床CRC患者血清樣本中驗證分析，結果發現血清miR-19a的表達水平可以鑒別對化療耐藥的CRC患者，其敏感性及特異性分別為66.7%、63.9%，AUC曲線下面積為0.679。從目前上述兩個CRC患者血清miRNA判斷化療敏感性研究得出，CRC患者血清中特征性miRNA可作為潛在的生物標志物應用于臨床CRC化療療效的判斷，尤其是化療敏感性的監測，但進一步的大規模臨床研究還有待于在以后的研究中開展。

目前，關于miRNA作為CRC生物標志物的相關研究已成為了研究的焦點，也取得了一定的研究成果，CRC患者血液中特征性miRNA有可能作為CRC篩查、早期診斷、預測監測及化療療效判斷的生物標志物。然而，由于目前大多數研究仍屬于臨床樣本量較小的回顧性研究。因此，今后仍需要開展大規模、多中心的前瞻性臨床研究進一步證實血清特征性miRNA能夠作為CRC患者早期診斷、預后判斷及化療療效監測的生物標志物，從而為CRC患者的臨床診治提供新的策略和思路。

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