HPLC-MS/MS快速測定嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量

楊旺火，黃永輝，陳言凱，劉飛，周鵬，柯振華，吳少明（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，福建福州350002）

HPLC-MS/MS快速測定嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量

楊旺火，黃永輝，陳言凱，劉飛，周鵬，柯振華，吳少明
（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，福建福州350002）

摘要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量的方法。以13C3-丙烯酰胺為同位素內(nèi)標，4%三氯乙酸水溶液作為提取液，經(jīng)NaCl鹽析，乙腈萃取凈化，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀多反應監(jiān)測模式進行測定，內(nèi)標法定量。該方法的線性范圍為12.24 ng/mL～612 ng/mL，相關系數(shù)r2>0.999 9，檢出限為7 μg/kg，定量限22 μg/kg。3種嬰幼兒食品及輔助食品中丙烯酰胺的加標回收率為96.5%～104.2%，相對標準偏差為0.9%～2.5%。本方法具有操作簡便、準確率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可應用于多種嬰幼兒食品中丙烯酰胺含量的測定。

關鍵詞：丙烯酰胺；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；嬰幼兒食品；同位素內(nèi)標

丙烯酰胺（acrylamide）是一種神經(jīng)毒素，馬鈴薯和谷類等淀粉類食品通過美拉德反應在高溫加工過程中生成，國際癌癥研究機構(gòu)已將其列為對人類很可能的ⅡA類致癌物質(zhì)[1]。自2002年瑞典國家食物管理局（Swedish National Food Administration）和斯德哥爾摩大學（Srockholm University）的科學家報道油炸馬鈴薯和焙烤食品中含有丙烯酰胺以及丙烯酰胺的潛在危害以來，德國、比利時、中國、日本等國的科學家相繼發(fā)現(xiàn)熱反應加工食品會產(chǎn)生丙烯酰胺[2-5]。

目前，我國食品中丙烯酰胺的監(jiān)測種類主要集中在油炸和焙烤食品中。然而，早在2007年，歐盟就已經(jīng)開始要求各成員國每年監(jiān)控包括嬰幼兒餅干、罐裝輔食和谷類輔助食品在內(nèi)的2000種食品中的丙烯酰胺含量。我國對嬰幼兒配方食品、谷類輔助食品和罐裝輔助食品等食品中丙烯酰胺的含量尚未進行風險監(jiān)控和暴露評估，而嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，更容易遭受危害，嬰幼兒食品中丙烯酰胺更需要進行嚴格的監(jiān)控。

目前丙烯酰胺的檢測方法主要有高效液相色譜法[6]、氣相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]等。國內(nèi)食品中丙烯酰胺的檢測標準主要有GB/T 5009.204-2005《食品中丙烯酰胺含量的測定方法氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法》及SN/T 2096-2008《食品中丙烯酰胺的檢測方法同位素內(nèi)標法》，兩個標準前處理樣品均需經(jīng)過提取，過固相色譜柱，過夜衍生，再萃取，然后上機處理，所用分析儀器是氣質(zhì)聯(lián)用儀，分析時間長，效率低，且操作過程復雜，容易造成被測物損失。因此，選擇簡便、快速的前處理方法，建立HPLC-MS方法對嬰幼兒食品中丙烯酰胺進行風險監(jiān)控和暴露評估，為企業(yè)在生產(chǎn)中降低該物質(zhì)的產(chǎn)生，指導人們健康飲食有著重要的意義。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1290 Infinity超高效液相色譜串聯(lián)6490三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；高速冷凍離心機（Aanti J-E）：美國Beckman Coulter公司；超純水純化系統(tǒng)（Milli-Q）：美國Millipore公司；分析天平（BT 224 S）：德國Sartorius公司；超聲波振蕩器（DS-8510 DTH）：上海生析超聲儀器有限公司；旋渦混均器（XH-B）：江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；0.22 μm尼龍濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司。

丙烯酰胺標準品（純度99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；丙烯酰胺標-13C3標準品（純度99%）：美國CIL公司；乙腈（色譜純）：山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；甲酸（優(yōu)級純）：德國Merck公司；所用試劑除特別標注外均為分析純試劑；試驗用水為超純水純化系統(tǒng)制備的超純水。

1.2標準溶液的制備

準確稱取0.030 9 g丙烯酰胺于25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解配制成濃度為1.224 mg/mL標準儲備溶液。吸取適量丙烯酰胺標準儲備溶液，用水配成24.48 μg/mL標準中間溶液。

吸取1.00 mL丙烯酰胺-13C3標準品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成濃度為39.6 μg/mL內(nèi)標儲備溶液。吸取適量內(nèi)標儲備溶液，用水配成濃度為1.584 μg/mL內(nèi)標中間溶液。

1.3樣品前處理

稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品，于40 mL的離心管中，加入丙烯酰胺-13C3內(nèi)標，加入10 mL 4%三氯乙酸溶液，渦旋后超聲30 min，在15 000 r/min、10℃下離心5 min，取上清液5 mL，加入NaCl固體顆粒使之飽和，加入5 mL乙腈振蕩萃取10 min，15 000 r/min離心取出乙腈層，下層再加入5 mL乙腈重復萃取一次，合并兩次乙腈層，氮吹濃縮至近干，純水定容1 mL，過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4液相色譜條件

色譜柱：WatersBEHC18柱，1.7μm，100mm×2.1mm；柱溫：40℃；進樣量：5.0 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：1%的甲醇和99%的0.3%甲酸水溶液，等度洗脫3.5 min。

1.5質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；毛細管電壓：3 000 V；干燥氣溫度：160℃；干燥氣流速：16 L/min；霧化氣壓力：206.85 kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：12 L/min；掃描模式：多反應監(jiān)測（MRM）；丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1流動相的選擇

試驗發(fā)現(xiàn)，采用水和甲醇為流動相時可以獲得較大的響應和較好的峰型。由于丙烯酰胺極性較大，在反相色譜柱上的保留較弱，所以，以1%甲醇的有機相比例作流動相。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在水相中加入適量甲酸有助于提高質(zhì)譜響應，優(yōu)化了0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%不同濃度的甲酸溶液的影響。發(fā)現(xiàn)當甲酸濃度在0.1%、0.2%時響應值變化不大，當濃度達到0.3%時響應增大明顯，但隨著濃度的增加，響應值反而下降，由于甲酸濃度高，流動相的pH降低，容易縮短柱子的壽命。因此本研究采用甲酸濃度為0.3%的水溶液作為水相。

2.2流速的選擇

不同流速對化合物的出峰時間、峰形都有一定影響，但流速太高會增加系統(tǒng)壓力，過高的壓力會縮短柱子使用壽命，試驗比較了0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min 4個不同流速對分析結(jié)果的影響。一方面，隨流速的提高，標樣的保留時間相應縮短，峰形也變得尖銳，峰寬變窄，另一方面，流速提高，保留時間的縮短，容易造成在實際樣品分析時目標物與基質(zhì)中雜質(zhì)的分離度變差，干擾目標物的測定，且當流速增大，系統(tǒng)壓力也增高，因此本研究選擇流速為0.3 mL/min較為適合。

2.3質(zhì)譜條件的確定

采用電噴霧離子源（ESI）正離子掃描模式對丙烯酰胺進行檢測，對標準溶液以MS2 Scan掃描模式進行母離子全掃描，得到響應最強的母離子m/z 72.1，然后以Product Ion掃描模式查找子離子，得到兩個響應最高，最穩(wěn)定的子離子m/z 55.1、m/z 44.2，最后通過MRM模式優(yōu)化兩組離子對的碰撞能量。以同樣的方法對丙烯酰胺-13C3內(nèi)標的母離子以及子離子進行掃描優(yōu)化，得到其母離子質(zhì)量數(shù)為75.1，特征碎片離子為m/ z 58.1、m/z 29.1。在確定掃描參數(shù)后，對其它質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為毛細管電壓3 000 V、干燥氣溫度160℃、干燥氣流速16 L/min、霧化氣壓力206.85 kPa、鞘氣溫度350℃、鞘氣流速12 L/min，掃描模式為多反應監(jiān)測（MRM），掃描參數(shù)見表1。

2.4樣品前處理條件的優(yōu)化

相關資料研究測定丙烯酰胺時用的最多的是水做為提取溶劑，另外有少部分用了乙腈、甲醇等作為提取溶劑。本試驗比較純水、1%甲酸水溶液、5%三氯乙酸水溶液、1%氨水、乙腈和甲醇對實際樣品中的丙烯酰胺的提取效果，發(fā)現(xiàn)用純水和5%三氯乙酸水溶液提取時，響應最大。此外三氯乙酸還能起到沉淀蛋白的作用，溶液澄清，有利于后續(xù)樣品的凈化濃縮。比較了1%、2%、3%、4%、5%5個不同三氯乙酸濃度作為提取溶劑對提取效果的影響，試驗發(fā)現(xiàn)當三氯乙酸濃度≥3%時，樣品離心后上層溶液較為澄清，且當三氯乙酸濃度為4%時目標物的峰面積響應值也相應較大，考慮到高濃度酸對系統(tǒng)壽命及穩(wěn)定性的影響，最后確定三氯乙酸提取液的濃度為4%。

丙烯酰胺的極性很強，采用水溶液作為提取溶劑時，水中溶解的極性物質(zhì)較多，容易有共流出物對檢測造成干擾，另一方面丙烯酰胺的分子量很小，質(zhì)譜所監(jiān)測離子質(zhì)量數(shù)在80以下，而在這個質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)譜測定時系統(tǒng)和流動相的分子碎片干擾比較嚴重，試驗過程中發(fā)現(xiàn)樣液中的丙烯酰胺所產(chǎn)生的質(zhì)量數(shù)為55.1的子離子有嚴重的離子干擾，造成離子比例嚴重偏離丙烯酰胺標準品的離子比例，影響定量和定性結(jié)果，因此需要減小樣品提取液的基質(zhì)效應，對其進行凈化處理。試驗采取了空白加標的方法，比較了PEP串聯(lián)MCX、PEP、MCX和乙腈+NaCl液液萃取凈化共4種方法的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種方法凈化后的目標物的離子比例均落在了偏差的允許范圍內(nèi)，而乙腈+NaCl液液萃取法和MCX柱法處理后樣品目標物相應明顯大于其它兩種方法，乙腈+NaCl方法的基線較MCX平穩(wěn)，同時MCX柱的價格較為昂貴，乙腈+ NaCl法價格低廉，因此選擇用乙腈+NaCl液液萃取法來對樣品提取液進行凈化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當用乙腈對提取液萃取兩次后，回收率基本達到90%以上，同時在處理過程加入同位素內(nèi)標，進一步校正了基質(zhì)效應的影響，滿足試驗要求，因此確定對提取液進行兩次的液液萃取凈化處理，合并的乙腈層經(jīng)氮吹、濃縮定容后上機測試，進一步提高檢測限。

2.5線性范圍及檢測限

準確移取丙烯酰胺及丙烯酰胺-13C3標準工作液，逐步稀釋制得質(zhì)量濃度為12.24、24.48、61.2、122.4、244.8、612 ng/mL系列標準溶液，其中內(nèi)標濃度為15.84 ng/mL，按照本試驗的操作條件下分析，以丙烯酰胺定量離子色譜峰與內(nèi)標峰面積比為縱坐標，丙烯酰胺標準溶液與內(nèi)標濃度比為橫坐標，繪制標準曲線，相應的回歸方程和相關系數(shù)為：Y=0.244 3 X+0.043 1，r2>0.999 9，結(jié)果表明在12.24 ng/mL～612 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關性良好。

依照國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）的定義，檢出限以信噪比S/N>3計，定量限以S/N>10計，按稱樣1.0 g，試驗過程稀釋倍數(shù)為2計算，得到本方法丙烯酰胺檢出限7 μg/kg，定量限為22 μg/kg，典型的加標樣品定量離子流圖譜見圖1。

2.6準確度和精密度

稱取未含丙烯酰胺的嬰幼兒奶粉和米粉樣品以及有丙烯酰胺本底的嬰幼兒餅干1.0g，分別添加3個不同含量水平的標準溶液，各做6個平行樣，重復測試3次，計算各自回收率和相對標準偏差。結(jié)果如表2所示。

平均回收率在96.5%～104.2%之間，相對標準偏差在0.9%～2.5%之間，說明該方法具有較強的可靠性。

2.7實際樣品檢測

采用該方法對各20個批次的奶粉、米粉和餅干3種基質(zhì)樣品進行檢測，其中奶粉和米粉樣品均未檢出丙烯酰胺，餅干中丙烯酰胺含量在110 μg/kg～130 μg/kg之間。由于丙烯酰胺是通過美拉德反應經(jīng)過高溫工藝后生成丙烯酰胺，因此與產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝關系非常密切，餅干的生產(chǎn)工藝通常要經(jīng)過油炸或擠壓等高溫處理，較容易生成丙烯酰胺。

3　結(jié)論

本方法采用4%的三氯乙酸作為提取液，既可以有效提取出嬰幼兒食品中的丙烯酰胺，對蛋白質(zhì)含量高樣品還能起到沉淀蛋白、澄清溶液的作用，在樣品的凈化處理步驟采用廉價的NaCl和乙腈液液萃取的方法，大大降低了檢測成本，同時在處理過程中加入同位素內(nèi)標，有效地校正了目標物的損失。本方法具有操作簡單、分析時間短、準確度高、經(jīng)濟適用等優(yōu)點，對我國開展嬰幼兒食品中丙烯酰胺的風險監(jiān)控和暴露評估工作具有很好的實際參考價值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.035

收稿日期：2014-07-07

基金項目：福建省質(zhì)量技術監(jiān)督局科技計劃項目（FJQI2012057）

作者簡介：楊旺火（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

Rapid Determination of Acrylamide in Infant Foods by HPLC-MS/MS

YANG Wang-huo，HUANG Yong-hui，CHEN Yan-kai，LIU Fei，ZHOU Peng，KE Zhen-hua，WU Shao-ming
（National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，F(xiàn)ujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350002，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：A method using isotope internal standard for determination acrylamide in infant foods had been established by ultra high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）.The sample was extracted with 4%trichloroacetic acid solution，and then purified by liquid-liquid extraction with acetonitrile，analyzed by HPLC-MS/MS in a multi-reaction monitoring （MRM）mode，an isotope internal standard was added for quantification.The correlation coefficient（r2）of acrylamide was more than 0.999 9 in linear range of 12.24 ng/mL-612 ng/mL.The detection limit and quantification limit were was 7 μg/kg and 22 μg/kg.The average spiked recoveries were in the range of 96.5%-104.2%with the relative standard deviations（RSD）of 0.9%-2.5%.The results showed this method was simple，high sensitivity，high accuracy and repeatable for the determination of acrylamide in kinds of infant foods.

Key words：acrylamide；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；infant food；isotope internal standard