籽粒莧營養面包酵母菌的分離與鑒定

趙娜，程金芝（白城師范學院，吉林白城137000）

籽粒莧營養面包酵母菌的分離與鑒定

趙娜，程金芝*
（白城師范學院，吉林白城137000）

摘要：從自然發酵的籽粒莧營養面包的生面團中分離得到一株具有潛在應用價值的產香味酵母菌Y-21菌株。通過常規的形態和生理生化特性以及ITS rDNA鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），并對其菌株進行發酵性能測試。結果表明Y-21菌株的最適發酵溫度為30℃，pH為5.5，在籽粒莧雜糧面包發酵與烘焙應用的初步研究中，面團發酵效果良好，可以充分發揮籽粒莧面包的獨特風味，具有潛在的應用價值。

關鍵詞：籽粒莧；面包酵母菌；分離；鑒定

籽粒莧屬于莧科（Amaranthceae），莧屬（Amaranthus）一年生草本植物，具有廣泛適應性[1]。本文所采用的籽粒莧為粒用莧，是1991年中國農科院從美國引進的R104品種，該品種特性籽粒多、高產而質優[2]。籽粒莧營養豐富，富含蛋白質，氨基酸組成合理，其中富含賴氨酸、精氨酸等谷類作物的限制性氨基酸，脂類以不飽和脂肪酸為主，含有角鯊烯，同時還富含鈣、鎂、鐵等礦物質元素[3-5]。籽粒莧籽實在國外被稱作健康食品，被作為食物使用，如籽粒莧餅干、面條、披薩、面包等烘焙食品[6-8]。由于“三高人群”的日益增多，人們越來越注重飲食健康，籽粒莧由于豐富的營養在國內也備受關注[9-10]。譬如：湖北農科院研制的籽粒莧降糖粉[11]，白城師范學院程金芝教授研究的籽粒莧酸乳[12-13]和面包小試產品均在研制開發中。但在實驗室研制開發的籽粒莧面包是利用商業活性干酵母釀制，香氣單薄，典型性不突出。為此，針對籽粒莧富纖維營養面包，篩選適合的專用酵母菌菌種[14-17]，在發酵與烘焙應用研究中可以充分發揮籽粒莧的獨特風味意義重大，同時也為籽粒莧食品產業化開發提供理論研究參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

籽粒莧品種R104：白城師范學院程金芝教授提供。

pMD18-T Vector：寶生物工程有限公司；引物合成及測序公司：華大基因；DNA片段凝膠回收試劑盒、小提質粒試劑盒：OMEGA公司；酵母浸膏、蛋白胨（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

HK-35A烤箱：廣州旭郎機械設備公司；HZQ-F16A型恒溫電熱培養箱：上海一恒科技有限公司；HZQF160全溫振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；PC-818A型PCR儀：日本ASTEC；DYCP-31C瓊脂糖水平電泳儀：北京六一；型凝膠成像系統：美國伯樂；UV-2800紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1籽粒莧自然發酵面團的制作

取一定量成熟飽滿籽粒莧種子，水淘除雜并烘干。然后將淘凈烘干的籽粒莧與水按料液比1∶10（g/mL）的比例榨成漿，之后用紗布過濾，所得的籽粒莧籽實置于烘箱中烘干，然后粉碎機制成籽粒莧籽實纖維粉。將稱量好的籽粒莧粉和配料按一定比例放入面盆中，加水慢速攪拌，使配料充分溶解混合，直至揉成軟硬適宜的面團。之后進行一次、二次醒發，并進行烘烤，最后對面包進行感官評價。

1.3.2酵母菌的分離和純化

將自然發酵生面團用28℃溫水稀釋形成乳濁液，過濾，將含有酵母菌的濾液用PDA液體培養基進行初步培養。將所培養混合菌液在PDA固體培養基上進行劃線培養，選取形態不同的單菌落，進一步劃線分離，美蘭染色，鏡檢，直至菌株為單一形態菌。最終將分離得到的酵母菌分離物進行編號，并保存于終濃度20%的甘油中或者接種斜面培養基保存。

1.3.3菌株的初步鑒定

1.3.3.1菌株形態學觀察

觀察復篩得到的性狀優良菌株的菌落形態，同時在光學顯微鏡下鏡檢細胞形態。

1.3.3.2菌株的生理生化特性鑒定

菌株的生理生化特性鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》一書中的方法進行操作[18]。

1.3.4菌株分子生物學鑒定序列分析與系統發育樹構建

參照邢福國2007年報道《酵母基因組的提取》文獻[19]中利用溶菌酶破壁的方法進行酵母菌菌株基因組DNA的提取。采用真菌ITS rDNA通用引物對ITS1 和 ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行分子生物學鑒定。50 μL PCR反應體系為：2 μL模板、1 μL正反引物、1 μL（10 mol/L）dNTP、5 μL 10×PCR buffer （MgCl2）、1 μL E×TaqDNA聚合酶，無菌純水補齊到50 μL。反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環，72℃延伸10 min。反應產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用OMEGA回收試劑盒進行PCR產物回收，并將回收DNA片段連接到pMD18-T載體上，轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，涂布于氨芐抗性的LB培養基平皿上，挑選陽性克隆進行測序。將測序結果提交至GenBank并獲得接受號，使用BLAST程序與數據庫中已有序列進行相似性比較分析，分析該菌株的分類地位。

1.3.5篩選酵母發酵特性研究

1.3.5.1Y-21菌株的最適溫度值測定

接種菌株至PDA液體培養基中，28℃培養過夜。調節菌液濃度，以接種量為最初濃度100 cfu/μL，分別在不同的發酵溫度（22、24、26、28、30、32、34、36、38、40℃）培養酵母，pH自然條件下發酵30 h，分別取樣2 mL，用可見分光光度計在600 nm波長處測其吸光度。

1.3.5.2Y-21菌株的最適pH測定

接種菌株至PDA液體培養基中，30℃培養過夜。調節菌液濃度，以接種量為最初濃度100 cfu/μL分別接種初始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0液體培養基中，30℃、120 r/min振蕩培養，培養14h取樣2mL，測定600 nm波長處吸光度。

1.3.5.3Y-21菌株生長曲線的測定

將菌株用PDA液體培養基培養14 h后，將菌液（調節菌液濃度100 cfu/μL）接種到滅菌的PDA液體培養基中，30℃恒溫搖床培養，觀察30 h菌株的生產情況，前期間隔2 h取樣，用可見分光光度計在600 nm波長處測其吸光度，繪制出Y-21菌株生長曲線的變化趨勢。

2　結果與分析

2.1籽粒莧面包的感官評價

籽粒莧面包感官質量評定[20]在面包冷卻回軟，未老化前進行，感官質量評定結果見表1。

2.2酵母菌的初步鑒定

2.2.1酵母菌Y-21菌株的形態特征觀察結果

將Y-21菌株接種于PDA培養基上，于28℃培養2d，酵母菌Y-21菌株的形態特征觀察結果如圖1所示。

菌落形態如圖1（a）所示，均為圓形，乳白色，質地均勻，邊緣整齊，表面光滑、濕潤、黏稠，易挑取，并散發淡淡的酒香味道。光學顯微鏡下鏡檢，如圖1（b）所示，可見圓形或橢圓形細胞，大小為（4.0～5.0）μm×（4.5～8.7）μm，為一端出芽生殖。

2.2.2酵母菌的生理生化特性鑒定結果

酵母菌的生理生化特性鑒定結果如表2所示。

由表2結果所示，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》檢索表可知，碳源中葡萄糖能被菌株Y-21同化；麥芽糖、乳糖、D-甘露醇、乳酸和可溶性淀粉均不能被同化。氮源中硝酸鉀和肌酸均不能被該菌株同化；尸胺和賴氨酸能被該菌株同化。并且，菌株在30℃培養試驗中生長良好，由此可以看出 Y-21菌株與Hanseniaspora屬的Hanseniaspora uvarum的特征極為相似。

2.3菌株的ITS通用引物的分子生物學鑒定結果及進化分析

以溶菌酶破壁法提取菌株的基因組DNA，以通用引物ITS rDNA擴增酵母菌整個ITS區域，擴增出的片段長度大約為750 bp，結果如圖2所示。

將PCR擴增片段連接pMD18-T，將陽性質粒送華大基因進行測序，將測序得到的結果在NCBI數據庫中進行同源序列搜索，得到與其親緣關系相近的已知酵母菌的相關信息，并采用MEGA 5.0軟件，利用鄰接法構建進化樹，結果如圖3所示。

由圖3可知，Y-21菌株與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）相似度非常高，結合形態學的特征，可得知Y-21菌株為的葡萄汁有孢漢遜酵母不同菌種。

2.4Y-21菌株特性研究

2.4.1溫度對Y-21菌株生長的影響

Y-21在不同溫度的PDA培養基中的生長曲線如圖4。

由圖4可知，Y-21菌株在溫度為30℃進行培養14 h后，菌量OD值可以達到最大值，并且可以達到相對穩定的狀態。

2.4.2pH對Y-21菌株生長的影響

Y-21在不同pH的PDA培養基中的生長曲線如圖5所示。

由圖5可知，當pH≤4時，酵母菌的生長相對較為緩慢；而當pH≥4.5時，酵母菌的吸光值明顯增長；當pH=5.5時，菌株OD值達到最大值，說明酸度對Y-21菌株的生長有一定的影響，該菌株的最適pH為5.5。

2.4.3Y-21菌株生長曲線的測定

Y-21在PDA培養基中的生長曲線如圖6所示。

綜上圖4、5、6可知，Y-21菌株最適培養溫度是30℃，最適pH為5.5，且在培養8 h左右開始進入對數生長期，培養至12 h～14 h時，OD值達到最大。

3　結論

通過對自然發酵的籽粒莧富纖維面包中酵母菌的定向分離、初篩、復篩以及生理生化的鑒定，獲得一株具有優良產香能力的酵母菌菌株Y-21。通過分子生物學鑒定，該菌株ITS rDNA片段總長為747 bp，將測得的序列提交到NCBI數據庫，并利用鄰接法構建該菌株的進化樹表明，Y-21菌株與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）相似度非常高，結合形態學的特征，最終鑒定Y-21菌株為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。本研究側重于適合于籽粒莧面包發酵的菌株的篩選與鑒定，以更能發酵籽粒莧的獨特味道，開發籽粒莧富纖維營養面包。有關該菌株對籽粒莧富纖維面包的發酵特性，還有待進一步的試驗研究。日報,2014-06-05(15)

參考文獻：

[1]孫鴻良,岳紹先.籽粒莧在國內外發展概況及四大優點[N].忻州

[2]孫鴻良,岳紹先.錢學森提出的第六次產業革命理論在籽粒莧草產業蓬勃發展中得到了驗證[J].中國種業,2015,3:9-12

[3]GIMPLINGER D M,ERLEY G S,DOBOS G,et al.Optimum crop densities for potential yield and harvestable yield of grain amaranth are conflicting[J].Europ JAgronomy,2008,28(2):119-125

[4]廖芙蓉,闞建全.籽粒莧花穗色素的穩定性研究[J].食品科學,2013, 34(5):127-131

[5]Juan Mario Sanz-Penella,José Moisés Laparra,Yolanda Sanz,et al. Bread Supplemented with Amaranth(Amaranthus cruentus):Effect of Phytates on In Vitro Iron Absorption[J].Plant Foods,2012,67:50-56

[6]J M Sanz-Penella,M Wronkowsk,M Soral-Smietana,et al.Effect of whole amaranth flour on bread properties and nutritive value[J]. LWT-Food Science and Technology,2013,50:679-685

[7]R Borneo,A Aguirre.Chemical composition,cooking quality,and consumer acceptance of pasta made with dried amaranth leaves flour [J].LWT-Food Science and Technology,2008,41(10):1748-1751

[8]Ana María Calderón de la Barca,María Elvira Rojas-Martínez,Alma Rosa Islas-Rubio,et al.Gluten-Free Breads and Cookies of Raw and Popped Amaranth Flours with Attractive Technological and Nutritional Qualities[J].Plant Foods,2010,65:241-246

[9] 張丹丹.淺談作物資源籽粒莧的開發與利用 [J].山東工業技術, 2013(14):246

[10]董文彥,劉德富,張東平,等.籽粒莧食品降血脂作用的實驗研究[J].食品科學,1996,17(5):40-43

[11]曾漢庭,王俊,陳明利,等.籽粒莧降糖保健食品生產技術研究[J].農產品加工(創新版),2009,182(8):30-32

[12]程金芝.純植物原料籽粒莧酸乳的研制[J].食品研究與開發,2011, 32(12):72-74

[13]程金芝,高晨光.籽粒莧乳酸菌發酵酸乳:中國,CN101856049A [P].2010-10-13

[14]王剛,邢家溧,印伯星,等.泡菜、豆醬中產香酵母菌的篩選及其在面包制作中的應用[J].食品科學,2014,35(23):155-160

[15]蔣瑾,魏練平,余梅,等.對從面包中篩選酵母菌及其發酵特性的研究[J].中國微生態學雜志,2011,23(2):127-130

[16]郝瑤,王陶,李文,等.富硒獼猴桃果酒酵母的篩選及鑒定[J].食品科學,2014,35(21):175-179

[17]KAPSOPOULOU K,KAPAKLIS A,SPYROPOULOS H.Growth and fermentationcharacteristicsofastrainofthewineyeast Kluyveromyces thermotolerans isolated in Greece[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2005,21(8):1599-1602

[18]巴尼特.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].胡瑞卿,譯.青島:青島海洋大學出版社,1990:120-397

[19]邢福國,張培軍,譚訓剛,等.酵母基因組的提取[J].食品科學, 2007,28(3):210-212

[20]徐虹,高思思,王思宇,等.紫薯面包配方和工藝研究[J].食品科學技術學報,2014,32(6):54-58

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.044

收稿日期：2015-10-26

基金項目：白城師范學院青年基金項目（2014C30號）

作者簡介：趙娜（1985—），女（漢），講師，博士在讀研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。

*通信作者

Screening and Identification of Yeast for Production of Bread from Grain Amaranth

ZHAO Na，CHENG Jin-zhi*
（Baicheng Normal University，Baicheng 137000，Jilin，China）

Abstract：A aroma-producing yeast of strain named as strain Y-21 was screened from sourdough of Grain amaranth Bread by spontaneous fermentation.Morphological characteristics，physiological and biochemical tests and ITS rDNA sequence analysis revealed that it belonged to the species Hanseniaspora uvarum.In addition，the properties of strains Y-21 were also studied.The results showed that the optimal pH were 5.5. Preliminary studies on bread fermentation using Y-21strain indicated that bread products showed good and unique aroma，This aroma-producing yeast will have potential applications in baked products.

Key words：grain amaranth；baker's yeast；isolation；identification