實時熒光HDA法快速檢測單核細胞增生李斯特菌

張明如，饒 麗，王建光，結 莉，丁洪流，沈曉芳,*

(1.江南大學食品學院,江蘇 無錫 214122；2.蘇州市產品質量監督檢驗所,江蘇 蘇州 215104)

實時熒光HDA法快速檢測單核細胞增生李斯特菌

張明如1，饒 麗1，王建光1，結 莉2，丁洪流2，沈曉芳1,*

(1.江南大學食品學院,江蘇 無錫 214122；2.蘇州市產品質量監督檢驗所,江蘇 蘇州 215104)

目的:建立一種用于單核細胞增生李斯特菌的實時熒光賴解旋酶恒溫核酸擴增（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）快速檢測方法。方法:針對單核細胞增生李斯特菌hly基因序列設計引物對，基于熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀的平臺，提取單核細胞增生李斯特菌基因組DNA，以此作為模板，優化反應溫度、反應時間及引物濃度。利用單核細胞增生李斯特菌及10 株對照菌株，并與實時熒光PCR對比，來驗證實時熒光HDA方法的特異性和靈敏度，并初步用于樣品檢測。結果:實時熒光HDA體系的最適引物濃度為0.075 μmol/L，反應溫度及反應時間為65 ℃、80 min（40 個循環），具有良好的特異性和靈敏度。結論:建立了一種特異性強、靈敏度高的實時熒光HDA檢測單核細胞增生李斯特菌的方法。

單核細胞增生李斯菌；hly基因；賴解旋酶恒溫擴增；實時熒光HDA；快速檢測

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是一種革蘭氏陽性短小無芽胞桿菌[1-2]。李斯特菌屬有2 個群共7 個種[3]，其中單核細胞增生李斯特菌是能引起人類疾病的一種重要的食源性致病菌。單增李斯特菌在自然界分布廣泛，蔬菜、乳制品、海產品、肉類和禽類等食品都已被證實是其傳播的載體[4]，該菌的易感人群主要是孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者，感染后主要會引起李斯特菌病、敗血癥、腦膜炎和流產等，致死率高達20%～50%[5-7]。2000年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）已將單增李斯特菌列為重點檢控的食源性致病菌之一[8-9]。

賴解旋酶DNA等溫擴增技術（helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）是由美國NEB公司研究人員Vincent等于2004年發明的一種新型核酸等溫擴增技術[10-11]，該技術模擬體內DNA在恒溫條件下進行復制的自然過程，在恒溫條件下利用生物復制系統的關鍵組分實現DNA的體外擴增。HDA主要是利用解旋酶在恒溫條件下解開DNA雙鏈，同時DNA單鏈結合蛋白穩定解開的單鏈為引物提供結合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補鏈。新合成的雙鏈在解旋酶的作用下又解成單鏈，并作為下一輪合成的模板進入循環擴增反應，最終實現靶序列的指數式增長[12-17]。HDA技術與傳統PCR的區別主要在于HDA通過添加解旋酶及單鏈結合蛋白在等溫條件下實現單鏈模板的循環生產，克服了傳統PCR需要依靠儀器反復升降溫來獲取單鏈模板的缺點。目前這種方法已應用于一些病原菌的檢測[18-21]。單增菌的致病性與多種毒力因子有關，其中溶血素O在單增菌侵染過程中扮演著重要角色，是單增菌的主要毒力因子，它存在于所有的致病性單增菌中，是能夠結合膽固醇，并且可被巰基活化的細胞溶解素[22-25]。溶血素O是由hly基因編碼而來的，本研究嘗試選取hly基因作為檢測靶基因，自行設計特異性引物，建立實時熒光HDA快速檢測單增李斯特菌的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的單核細胞增生李斯特菌株和實驗菌株如表1所示。標準菌株分別購自美國典型菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）和中國醫學細菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）。

HDA等溫擴增試劑盒（IsoAmpⅡ tHDA kit） 美國New England Biolabs（NEB）公司；7500熒光定量PCR儀美國ABI公司；Maxima SYBR Green qPCR預混液 美國Thermo Fisher Scientific公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；培養基廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據單增李斯特菌ATCC19115在GenBank中hly基因的登錄號JN703919.1，應用BatchPrimer3設計多對引物，分別篩選出適合實時熒光HDA和實時熒光PCR的引物對見表2，引物由生工生物工程（上海)股份有限公司合成。

1.2.2 細菌基因組DNA的提取

分別通過試劑盒法和熱裂解法提取各菌株基因組DNA，并用Epoch微孔板分光光度計進行DNA檢測，結果表明2 種方法提取到的DNA差異不大，因此選擇熱裂解法提取各菌株的DNA。試劑盒法提取步驟詳見試劑盒說明書，熱裂解法提取步驟:取1 mL菌懸液于EP管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清液；取500 μL滅菌水吹打沉淀，12 000 r/min離心1 min，棄上清液；重復上一步驟；取100 μL滅菌水吹打沉淀，沸水浴10 min，12 000 r/min離心1 min；取上清液至另一EP管，-20 ℃保存。

1.2.3 實時熒光HDA方法的建立

熱裂解法提取菌株DNA，按HDA等溫擴增試劑盒建立反應體系，并對引物終濃度、反應溫度及反應時間進行優化。按照優化后的方法對各菌株提取的DNA進行實時熒光HDA擴增，驗證方法的可行性。實時熒光PCR擴增方法參照反應試劑盒說明書，在7500熒光定量PCR儀上進行。

1.2.4 引物特異性實驗

以單增李斯特菌株及對照菌株提取的DNA為模板，分別采用實時熒光HDA和實時熒光PCR方法進行實驗，驗證各自引物的特異性。

1.2.5 單增李斯特菌純培養靈敏度實驗

將單增李斯特標準菌株ATCC19115活化，接種至適宜的培養基中進行增菌培養，并用濁度儀檢測其菌懸液濃度（1.2×108CFU/mL），將菌懸液進行10 倍梯度稀釋，用熱裂解法提取各梯度單增李斯特菌基因組DNA，以此為模板進行實時熒光HDA和PCR實驗，驗證其檢測靈敏度。

1.2.6 人工污染鮮肉中單增李斯特菌最低檢測限實驗

對實驗中用到的新鮮牛肉用國標的方法進行檢測，證明不含單增李斯特菌。將增菌培養的單增李斯特菌菌懸液進行10 倍梯度稀釋，對應的人工污染到牛肉中，具體操作:將市售牛肉進行攪拌，加少些生理鹽水進行均質，稱取30 g樣品加入到270 mL生理鹽水中，混合均勻并分成10份，每等份29 mL，進行滅菌。把稀釋好的單增李斯特菌對應的污染到肉勻漿液中。用熱裂解法提取各梯度污染的肉勻漿DNA，以此作為模板進行實時熒光HDA和PCR實驗，驗證其最低檢測限。

2 結果與分析

2.1 建立及優化反應體系及反應條件

實時熒光HDA反應體系（25 μL）:dd H2O 12.5 μL，10×Annealing buffer 2.5 μL，MgSO4（100 mmol/L）1 μL，NaCl（500 mmol/L） 2 μL，IsoAmp dNTP Solution 1.75 μL，Forward Primer（5 μmol/L） 0.375 μL，Reverse Primer（5 μmol/L） 0.375 μL，DNA 2 μL，IsoAmp Enzyme Mix 1.75 μL，EvaGreen（20×，Biotium）0.25 μL，ROX Reference Dye（50×，Invitrogen）0.5 μL。體系的最適引物濃度為0.075 μmol/L。

實時熒光PCR反應體系（25 μL）:dd H2O 7.45 μL，qPCR Mix 12.5 μL，Forward Primer（5 μmol）1.5 μL，Reverse Primer（5 μmol） 1.5 μL，DNA 2 μL，ROX 0.05 μL（使用前按說明書稀釋）。

反應程序見表3。

2.2 引物特異性實驗結果

由于引物設計參數的不同，HDA反應和PCR的最適引物有所不同。所以本實驗分別針對HDA和PCR方法設計各自最適引物（表2），各自的擴增結果如圖1所示。結果表明實時熒光HDA和PCR對單增李斯特菌都有較好的特異性，但從曲線可以看出，HDA方法可在較短時間內快速達到穩定期，擴增效率較高。

2.3 單增李斯特菌純培養靈敏度檢測實驗結果

將菌懸液濃度1.2×108CFU/mL的單增李斯特菌進行10 倍梯度稀釋，提取每個稀釋度的菌懸液DNA，分別用HDA及PCR方法進行擴增，比較兩種方法的檢測靈敏度，由圖2可以看出，單增李斯特菌純培養HDA方法的最低檢測限是1.2×102CFU/mL，PCR方法的最低檢測限是1.2×103CFU/mL，所以實時熒光HDA的檢測靈敏度要微高于實時熒光PCR，且更易達到穩定期。

2.4 人工污染鮮肉中單增李斯特菌最低檢測限實驗結果

將經過增菌純培養的單增李斯特菌懸液10 倍梯度稀釋后對應的人工污染到滅菌后的牛肉勻漿液中，經計算可知人工污染樣品的菌懸液濃度是1.2×107～1.2×10-2CFU/mL，熱裂解法分別提取污染樣品的DNA，以此作為模板進行HDA和PCR擴增，驗證兩種方法的最低檢測限，由圖3的擴增曲線可知，HDA和PCR可以檢測到的最低單增李斯特菌濃度是一樣的，都是1.2×104CFU/mL。說明實時熒光HDA和實時熒光PCR的樣品最低檢測限相當。

2.5 樣品檢測驗證實驗結果

用實時熒光HDA方法對90 份送檢食品、市售食品和人工污染食品進行檢測，結果如表4所示。其中有3 份單核細胞增生李斯特菌陽性樣品，經實時熒光PCR和國標法GB 4789.30—2010 《食品微生物學檢驗:單核細胞增生李斯特菌檢驗》復檢，檢測結果一致，由此可知，實時熒光HDA檢測方法具有良好的特異性和靈敏度。

3 討 論

單核細胞增生李斯特菌是全球重點監控的食源性病原菌，快速、低成本檢測是發展方向，傳統的單增李斯特菌的檢測方法主要有國標法、酶聯免疫和PCR方法，國標法雖然成本低，但培養時間較長，且容易漏檢；酶聯免疫法是蛋白質水平的檢測方法，靈敏度高于國標法，但有較多的影響因素，如加樣方式、溫育溫度、洗滌方法等，實驗的過程性分析較為復雜；普通PCR法擴增后，通過電泳條帶判斷目標產物大小，但是不能排除非特異性擴增，且很多電泳染料不利于人體健康；實時熒光PCR具有較高的靈敏度和特異性，但是需要昂貴的儀器設備，不易在基層應用，且儀器設備通常體積較大，不易進行戶外或現場檢測；近年來廣泛被研究的環介導恒溫擴增檢測法雖然反應過程簡單，無需使用PCR儀，但設計復雜，對靶序列要求較高，且耗時較長。基于靶基因檢測的各種基因體外放大技術，都沒法實現現場檢測， HDA方法的最大優點是可以真正意義上達到恒溫擴增，作為一種新的恒溫擴增方法，HDA模擬生物體內DNA的合成方法，由解旋酶解開DNA雙鏈替代PCR中的高溫，擴增原理簡單，耗時較短。普通的HDA擴增只需要一個恒溫的環境即可進行，對設備要求較低。由以上實驗可知實時熒光HDA具有較高的靈敏度和特異性，因為是新型的方法，所以目前的實時熒光HDA實驗是基于熒光定量PCR儀進行的。本課題組基于HDA擴增原理，在研究對應的實時熒光HDA儀器，相信在不久的將來，低成本、易操作的實時熒光HDA儀有望應用于基層實驗室和現場檢測。

綜上所述，本實驗建立的實時熒光HDA檢測方法可實現恒溫擴增無需大型設備，且檢測靈敏度和特異性等同于實時熒光定量PCR，未來在配備相關設備后，將具有良好的應用和發展前景。

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Real-Time Fluorescence Helicase-Dependent Isothermal DNA Amplification Method for Rapid Detection of Listeria monocytogenes in Foods

ZHANG Mingru1, RAO Li1, WANG Jianguang1, JIE Li2, DING Hongliu2, SHEN Xiaofang1,*
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Suzhou Product Quality Supervision and Inspection Institute, Suzhou 215104, China)

The purpose of this study was to develop a real-time helicase-dependent isothermal DNA amplification (HDA) method for the rapid detection of Listeria monocytogenes. Based on the platform of real-time PCR, pairs of primers targeting the hemolysin gene (hly) of Listeria monocytogenes were designed, and genomic DNA was extracted from a standard strain of L. monocytogenes for use as the template. The reaction temperature, primers and template DNA concentration were optimized. Compared with real-time PCR method, the specificity and sensitivity of the real-time HDA method were evaluated with L. monocytogenes and 10 bacteria control strains, and then this developed method was used to detect L. monocytogenes in real samples. The results showed that the optimal primer concentration, reaction temperature and time for real-time HDA system were 0.075 mol/L, 65 ℃ and 80 min (40 cycles), respectively. This system showed a high specificity and sensitivity. Thus a real-time HDA method for rapid and specific detection of L. monocytogenes has been successfully established.

Listeria monocytogenes; hemolysin gene; helicase-dependent isothermal amplification; real-time fluorescence HDA; rapid detection

R155.5

A

10.7506/spkx1002-6630-201510041

2014-08-18

蘇州科技局科技支撐計劃項目(SS201338)

張明如(1988—),女,碩士,研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：yyzmrhxn@163.com

*通信作者：沈曉芳(1976—),男,副教授,博士,研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：xfshen@jiangnan.edu.cn