應用LNA-TaqMan探針實時熒光PCR檢測大米制品中轉基因成分

潘 廣，章桂明，陳枝楠，程穎慧，向才玉，包先雨，凌杏園,*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心,廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗檢疫科 學研究院,廣東 深圳 518010)

應用LNA-TaqMan探針實時熒光PCR檢測大米制品中轉基因成分

潘 廣1，章桂明1，陳枝楠2，程穎慧1，向才玉1，包先雨2，凌杏園1,*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心,廣東 深圳 518045；2.深圳市檢驗檢疫科 學研究院,廣東 深圳 518010)

大米制品中痕量轉基因成分的檢測需要特異和超靈敏的檢測方法。本研究以行業標準中轉基因大米篩查位點CaMV35S啟動子、NOS終止子和Cry1A基因為目標，利用在常規TaqMan探針中摻入鎖核苷酸提高探針退火溫度和雜交特異性等特點，經比較以上位點不同LNA-T aqMan探針實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測效果，建立了針對上述篩查位點的基于LNA-TaqMan探針的新型實時熒光PCR檢測方法。該方法特異性強，檢測靈敏度超高；與普通TaqMan實時熒光PCR方法相比，其反應Ct值可提前1～3個循環（Cry1A位點除外），檢測低限可達3 pg。該檢測方法可以用以檢測大米制品中常規實時熒光PCR難以檢測到的痕量轉基因大米成分。

大米制品；鎖核酸；鎖核酸探針；實時熒光PCR

大米是我國最主要的主糧之一，其安全性特別是轉基因情況倍受百姓關注。目前，國際上有5 個已批準商業化生產的轉基因水稻品種，它們是拜耳公司研發的LLRICE06、LLRIC E601和LLRICE62，日本研發的7Crp#10和伊朗研發的Tarom molaii+cry1Ab。我國是最早開展轉基因水稻研究的主要國家之一，截至2009年，我國有記錄的田間試驗達4 000多次，其中水稻有480余次[1]；僅國內外文獻已披露的我國轉基因水稻品系就有Bt汕優63、華 恢1號、科豐6號、科豐8號、科螟稻等[2-4]，其中品系Bt汕優63和華恢1號于2010年獲農業部頒發的生物安全證書。我國迄今未批準任何轉基因大米的進口，也未批準任何國內的轉基因水稻商業化種植；因此，國內市場以及在出口的大米和米制品中不應含有任何的轉基因成分。然而，僅在2012年，我國出口到歐盟的大米制品如米粉、米線、米條等被通報檢出非法轉基因成分的就達到32 次之多[5]。這不僅給出口企業造成了直接的經濟損失，更重要的是影響了我國出口產品的聲譽。

出現上述情況，一是因為轉基因品種或品系資源在環境釋放等環節存在監管上的漏洞；其二是我國轉基因水稻未商業化種植，出現在普通大米中的轉基因大米往往是污染造成的，本身含量就很低，加上米制品在加工生產過程中，其基因組DNA高度降解，以目前常規聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和實時熒光PCR為主的轉基因檢測方法往往難以檢出這些痕量的轉基因成分。因此，有必要研發專門針對米制品等加工食品的痕量轉基因成分的檢測技術，以確保對這些大米制品中的轉基因成分“檢得出”和“檢的準”。

L AN-TaqTan探針是一種應用于實時熒光PCR的新型的探針。由于其在常規TaqMan探針中參入了鎖核苷酸（locked nucleotide acid，LAN），大大提高探針與目標序列的親和力，提高了探針的Tm值，從而可使探針設計的更短，進而適應于超短DNA片段的檢測，因此檢測靈敏度更高[6]。本研究以米制品為材料，以行業標準中篩查轉基因大米成分的CaMV35S啟動子、NOS終止子和Cry1A基因為目標[7]，設計和制備了摻入不等鎖核苷酸的超短的LNA-TaqMan探針。通過對不同的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR擴增效果比較，篩選得到了檢測上述3 個外源基因的LNA-TaqMan短探針，進而建立了針對上述篩查基因的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR檢測方法。該方法特異性強、靈敏度高，特別適于大米制品等加工食品中含上述外源基因的轉基因成分的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

爆米花、旺旺大米餅、旺旺黑米雪餅、旺旺大米海苔、貝殼米粉、東莞米粉、河源米粉、桂林米粉、江西米粉和云南米線均采自超市。

轉基因玉米標準品Bt11 歐盟標準局；轉基因大米標準品LLRice62、LLRice601 美國美國油脂化學家協會；轉基因水稻（大米）科豐8號、科豐6號和Bt汕優63參照樣品由中國檢驗檢疫科學研究院；大米制品米粉1、2和3號、東北五常大米、泰國香米及非轉基因大豆、非轉基因油菜、非轉基因玉米、非轉基因棉花和非轉基因小麥均由本實驗室收集。

實時熒光PCR反應用試劑盒TaqMan Enviromental Master Mix 2.0 美國Applied Biosystems公司。CTAB核酸提取液和沉淀液等均由實驗室自行配制。

1.2 儀器與設備

離心機 美國貝克曼庫爾特公司；渦旋震蕩儀 德國IKA公司；恒溫水浴鍋 北京六一公司；NanoDrop2000c分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；7900實時熒光PCR儀 美國Applied Biosystem公司；純水器 美國Millipore純水器。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與制備

DNA提取方法采用GB/T 19495.3—2004《轉基因產品檢測:核酸提取純化方法》中的CTAB-2方法[8]，用NanoDrop2000c測定其濃度和質量。DNA質量濃度按照下式計算:

C=A×N×50

式中:C為DNA質量濃度/（ng/μL）；A為260 nm波長處的吸光度；N為核酸稀釋倍數。當A260nm/A280nm比值在1.7～1.9之間時，適宜于PCR擴增。

1.3.2 LNA-TaqMan探針和引物

引物序列、LNA-TaqMan探針序列以及鎖核苷酸摻入位置見表1，以上探針和引物均由江蘇碩世生物科技有限公司合成。

1.3.3 實時熒光PCR反應體系和反應條件

實時熒光PCR擴增反應體系20 μL，其中2× TaqMan Enviromental Mix 2.0 10 μL，DNA模板（50 ng/μL）3 μL，正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，探針（10 μmol/L）1 μL，用雙蒸水補足體積至20 μL，每個試樣重復3 次PCR反應，同時設空白對照、陽性對照和陰性對照。

擴增反應在ABI7900型實時熒光PCR儀上進行。擴增反應采用兩步法:95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個循環。

1.3.4 實時熒光PCR反應特異性測定

用2% Bt11、10%科豐6號、100%科豐8號、100%克螟稻、5%Bt汕優63、LLRice62、LLRice601、東北大米、泰國香米以及非轉基因大豆、非轉基因油菜、非轉基因玉米、非轉基因棉花和非轉基因小麥共總計14 個不同轉基因或非轉基因樣品測試方法的特異性。

1.3.5 檢測低限的測定

將100%科豐8號轉基因大米基因組DNA，用10 倍梯度系列稀釋成10 ng/μL～0.1 pg/μL共6 個質量濃度梯度，每PCR反應加3 μL，每個質量濃度重復3 次PCR反應。發生擴增反應的最低樣品質量濃度或基因組DNA量即該方法的檢測低限。

1.3.6 實時熒光PCR反應效率測定

按檢測低限測定方法配制標準梯度樣品，以樣品擴增的Ct值為Y軸，標準梯度樣品DNA拷貝數（或濃度）的對數為X軸，根據標準梯度樣品的Ct值和基因組DNA拷貝數（或濃度）的對數繪制標準曲線（Ct=k×lg（DNA拷貝數）+b），計算標準曲線的線性斜率k值。根據公式E=10-1/k-1計算定量PCR的擴增效率。

1.3.7 實際樣品檢測實驗

用所建立的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR方法和普通TaqMan探針實時熒光PCR方法同時對13 份米制品進行檢測，每檢測位點重復3 次檢測。兩者除了探針引物不同之外，其他其他反應體系、DNA用量和反應條件完成一致。

2 結果與分析

2.1 方法的建立

行業標準SN/T 2584—2010《水稻及其產品中轉基因成分實時熒光PCR檢測方法》[8]規定了篩查轉基因水稻成分外源基因CaMV35S、NOS和Cry1A的實時熒光PCR檢測方法。本研究以上述3 種基因標準方法檢測目標區序列為基礎，設計摻入鎖核苷酸的LNA-TaqMan的短探針和引物。由于摻入鎖核苷酸的數目和位置直接影響探針的長短和實時熒光PCR反應的效果，本研究以100%科豐8號樣品DNA為材料，將這些設計制備的鎖核酸探針（包括相配套的引物）的實時熒光PCR反應在同等條件下與標準SN/T 2584—2010規定的實時熒光反應進行比較，根據實時熒光PCR反應Ct值提前最多（或大）同時鎖核酸探針最短的原則，最終確定了檢測CaMV35S、NOS和Cry1A位點的鎖核酸探針和引物序列（表1）。上述三位點中CaMV35S和NOS的基于鎖核酸探針的實時熒光PCR反應在不同DNA濃度時Ct值比相應普通探針實時熒光PCR方法均提前1～3個循環（表2）；位點Cry1A不同濃度檢測Ct值提高沒有規律，但設計的探針比普通TaqMan探針大大縮短。以上結果表明這種基于LNA-TaqMan探針檢測方法的靈敏度有了很大地提高。

2.2 特異性實驗結果

如表3所示，CaMV35S基因在KF6、Bt11、KF8、KMD1、LLRice6和LLRice601等轉基因樣品中實際存在[4,9-13]，而本實驗的特異性檢測結果與其一致；NOS基因和Cry1A基因也得到了相同的結果；同時上述3 個基因均沒有在泰國香米、東北大米和其他非轉基因植物中檢出。以上結果表明本研究建立的檢測方法特異性強。

2.3 檢測低限測定結果

以100%科豐8號樣品DNA通過梯度稀釋獲得的30、3 ng，300、30、3 pg和0.3 pg的總DNA模板量進行實時熒光PCR擴增，每個DNA樣品重復3 次。表4顯示，對于300 pg的轉基因含量100%的DNA樣品來說，3 個篩查基因均得到有效擴增，且其Ct值均小于35，且不同重復間曲線重合性較好（圖1～3）。對于30 pg的轉基因含量100%的DNA樣品來說，CaMV35S基因只有一個出現擴增，且Ct值已超過37（圖1未給出擴增曲線），表明其檢測低限低于300 pg；但NOS基因和Cry1A基因兩者均可以檢出，且Ct值在30左右，且重復性較好（圖2和圖3），可見該兩基因的檢測方法的靈敏度優于CaMV35S。對于3 pg和0.3 pg的轉基因含量100%的DNA樣品來說，NOS基因和Cry1A基因兩者均有擴增，NOS基因擴增重復性較好（圖2），Ct值在37左右；Cry1A基因在3 次重復中只擴增出1 次，Ct值已在37左右，可見0.3 pg基因組DNA（100%轉基因含量）是兩基因的檢測低限。另外，計算擴增效率顯示，CaMV35S、NOS和Cry1A基因的擴增效率分別為120%、105%和105%。

2.4 實際樣品的檢測結果

用建立的LNA-TaqMan探針實時熒光PCR方法和普通TaqMan探針實時熒光PCR方法同時對13份米制品進行檢測，每位點重復3 次檢測，Ct值取其平均值，檢測結果見表5。從表5可以看出，13 個米制品中提取的基因組DNA質量很好，沒有抑制PCR擴增的物質存在，因為內源基因Gos9擴增效果好；3 種旺旺米制品和爆米花內源基因Gos9擴增Ct值高，表明大米制品DNA的降解比另外9 種米粉和米線產品程度大。從2 種方法外源基因的擴增Ct值可以看出，2號、3號、東莞、河源、桂林和江西米粉6個樣品2 種實時熒光PCR均有擴增信號，其Ct值在33.12～38.89之間，表明它們含轉基因成分，但含量低，是典型的弱陽性樣品。旺旺大米餅2 種探針檢測均無擴增信號，表明該大米制品不含轉基因大米成分。而對于其他6 種大米制品兩種方法檢測的結論不同，普通TaqMan探針實時熒光PCR檢測結果為陰性，而本研究建立的方法檢測結果為陽性，因為CaMV35S基因檢測呈陽性。從表5還可以看出，位點CaMV35S和NOS位點鎖核酸探針實時熒光PCR檢測Ct值比普通實時熒光PCR方法均提前1～3各循環；對于位點Cry1A，含LNA探針實時熒光PCR反應Ct值也均有提前，但對樣品桂林米粉和江西米粉Ct值提前不到1 個循環（表5中帶“*”的Ct值）。可見本新方法的檢測靈敏度優于行業標準使用的普通探針實時熒光檢測方法。這是因為鎖核酸探針與靶序列DNA結合穩定性高、熒光信號強、嘈音低，熒光信號更易為PCR儀檢出；另外，由于鎖核酸探針比普通探針短很多（表1），對于DNA高度降解的加工食品，其有效模板數相對增加了。

3 討 論

目前，針對大米制品等加工食品低痕量轉基因成分的檢測方法，主要有TaqMan或SYBR Green實時熒光PCR和巢式PCR等分子檢測方法[9,14-16]，其檢測靈敏度可達0.01%（質量百分比）。但這些PCR方法的檢測目標DNA一般在100 bp以上，由于加工食品中DNA遭到高度降解，許多DNA片段小于以上長度，因而進一步降低加工食品中PCR反應有效的起始模板數，致使這些方法的實際檢測靈敏度大大降低。而巢式PCR還存在易污染、假陰性等現象。因此，對加工食品高度降解后短片斷DNA的檢測，是提高檢測靈敏度高的關鍵。

LNAs是核酸的類似物，其與普通寡核苷酸類似物相比在其碳環的2’氧原子和4’碳原子位置引入亞甲基橋形成鎖狀結構，由于LNA與DNA/RNA在結構上具有相同的磷酸鹽骨架，其不但可以與DNA、RNA結合成雙鏈，且其雙鏈的熱穩定性更高。據研究在普通探針中引入一個LNA堿基可增強探針和底物結合的穩定性，提高探針Tm（退火溫度）3～8 ℃并使TaqMan探針信號增強、信噪比增大[17-18]。因此，相同長度的含LNA的雜交探針比普通雜交探針與目標序列的雜交特異性更高，目前含LNA雜交探針的這一特點已應用于如芯片、原位雜交等分子生物學領域[19]。同理，在相同解鏈溫度條件下，LNATaqMan探針比普通TaqMan探針短。LNA-TaqMan探針可以設計較得更短的這一特點已應用于檢測復雜目標序列，如AT或GC富含區。Tranh等[20]應用LNA-TaqMan探針RT-PCR檢測H5N1流感病毒，并指出LNA探針因其檢測的高效率性而與實時熒光定量PCR結合用于臨床疾病檢測。韋信賢等[21]應用LNA-TaqMan探針熒光定量PCR快速檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒，證明該方法檢測IHHNV的靈敏度高，可以檢測到約10 個病毒粒子/反應，且特異性、重復性和重現性較好。

LNA-TaqMan探針比常規TaqMan探針可設計得更短，可以適于加工食品中降解DNA的檢測，然而這一特點迄今未用于轉基因檢測。本實驗通過比較分析轉基因大米常見品系的分子特征，選擇覆蓋面廣的CaMV35S、NOS和Cry1A基因作為篩查基因，并針對這3 個位點設計了鎖核酸檢測引物和探針，使檢測的目標序列比普通實時熒光檢測目標區大大縮短。這些位點的基于LNATaqMan探針的檢測方法特異性強，檢測靈敏度非常高，檢測低限可以達到0.3 pg，根據理論推算，一個單倍體水稻基因組的大小為0.47 pg[4]，該方法等同于能檢測到1 個拷貝左右的目的基因。重復性實驗表明所建立的方法具有較好的穩定性，在不同重復間曲線擬合性較好。在對實際轉基因米粉樣品進行檢測時，可以快速、準確地檢測出米制品中的痕量轉基因成分。該方法與普通TaqMan探針法相比不僅檢測靈敏度較高、重現性好，而且Ct值明顯提高。根據標準要求，如實時熒光PCR檢測Ct值大于36，須重新對樣品進行檢測。LNA-TaqMan探針實時熒光PCR檢測Ct值提前這一特點，利于弱陽性樣品檢測Ct值降到36以下，從而利于結果的判斷，避免重新檢測樣品，節約了檢測成本。

本研究應用LNA-TaqMan探針解決了米制品等食品中含位點CaMV35S、NOS和Cry1A痕量轉基因成分的檢測難題。其他轉基因篩查位點的檢測同樣可以采用LNATaqMan探針，來建立超靈敏和高特異性檢測方法。轉基因品系檢測比轉基因篩查更能區分產品中批準和未批準的轉基因成分，今后采用本研究方法研究建立以轉基因品系邊界序列為目標的基于LNA-TaqMan探針的實時熒光PCR檢測方法意義更為重要。

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Ultra-Sensitive Detection of Genetically Modified Ingredients in Rice-Derived Products Using Real-Time PCR with Locked Nucleic Acid TaqMan Probe

PAN Guang1, ZHANG Guiming1, CHEN Zhinan2, CHENG Yinghui1, XIANG Caiyu1, BAO Xianyu2, LING Xingyuan1,*
(1. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 2. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518010, China)

This study aimed to establish a specific and ultra-sensitive detection method for trace genetically modified (GMO) ingredients in rice-derived products. In this study, the CaMV35S promoter, NOS terminator and Cry1A gene included in the industrial standard for screening the GM components of rice were selected as the targets. By substituting a few nucleotides of the TaqMan probe with locked nucleic acid (LNA) nucleotide and comparing the performances of these LNA-TaqMan probes in real-time PCR (RT-qPCR), a novel real-time PCR method based on LNA-TaqMan probe for the above genes and gene elements was established with high specificity. Compared to the conventional RT-PCR with TaqMan probe, this RTPCR with LAN-Taqman probe was much more sensitive, ha d lower limit of detection (LOD) (0.001% by mass) and 1-3 less Ct value cycles except for Cry1A. This reported new PCR method can be applied for the detection of trace GM components in rice-derived products that could not be detected with the conventional RT-PCR probe.

rice-de rived products; locked nucleic acid (LNA); LNA-TaqMan probe; real-time PCR

S511

A

10.7506/spkx1002-6630-201510042

2014-07-24

深圳市科技研發資金基礎研究計劃重點項目(JC201105190969A)；國家轉基因重大專項 (2014ZX08012-001)

潘廣(1985—),男,農藝師,碩士,研究方向為轉基因產品檢測技術。E-mail：pg0101@126.com

*通信作者：凌杏園(1964—),男,高級農藝師,博士,研究方向為植物基因工程和分子生物學。E-mail：lxy6421@qq.com