人類受精相關精子功能蛋白質研究進展

張蔚，李建遠，谷翊群＊

（1.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；2.國家衛生計生委男性生殖健康重點實驗室，國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081）

目前不育癥患病率逐年增高，全球已有約15%的夫婦患有不育癥［1］。在不育癥的發病因素中，男性因素占到了50%［2］，對男性不育病因的評價結果將影響不育癥的治療方法選擇。現在臨床上仍使用常規精液分析作為檢測和評價男性生育力的主要方法，評價指標主要包括精子數量、精子運動能力和正常精子形態學的百分率，這些指標只能反映出達到自然妊娠所要求的最低精子質量，不能反映精子功能與超微結構的損傷。并且受每次射精的內在變異性與精液分析的精準性限制，常規精液分析結果并不能直接反映出精子的實際受精能力，無法準確評價男性生育力。近10年精子蛋白質組學得到長足發展［3］，尤其是比較精子蛋白質組學通過比較不同質量精液標本的蛋白質表達，能鑒定出某些可能導致男性不育的獨特精子蛋白質［4］。這些與精子受精功能相關的蛋白質有可能成為診斷男性不育和評估預后的新標志物，從而能夠更準確地判斷男性的生育狀態和生殖潛能，為患者提供更準確、更經濟的治療手段。本文按照自然狀態下精子受精的生理過程對人類受精相關精子功能蛋白質予以綜述，闡述這些蛋白質分子在精子受精過程中發揮的作用，并對其在評價男性生殖潛能上的應用前景予以展望。

一、精子運動及獲能

精子在睪丸產生，經過附睪后形態學與功能上已經發育成熟，但還不具有使卵母細胞受精的能力［5］。只有當精子從男性生殖道射出并進入女性生殖道后，去獲能因子被解除，精子膜的流動性和通透性增加［6-8］，精子發生超活化并且獲能后才會快速運動突破女性生殖道生理屏障與卵母細胞相遇，繼而發生頂體反應直至使卵母細胞受精［9］。與精子運動及獲能有關的人類精子功能蛋白質如下：

1.去整合素區和金屬蛋白酶區蛋白（ADAM）：ADAM 是近年來發現的一組錨定于細胞膜的細胞表面蛋白家族，該家族成員具有顯著的結構特點，有數個較為保守的潛在功能區。目前發現人類ADAM家族有26 個成員，其中超過一半的蛋白特異性或者主要表達于睪丸和附睪組織，這意味著它們在男性生殖中發揮著重要作用［10］。大部分ADAM蛋白在生精細胞以前體形式合成，在精子發生和附睪運輸中發生水解被切割成為成熟形式表達在精子表面。ADAMs多以復合物的形式存在，如ADAM1β-ADAM2，ADAM2-ADAM3-ADAM4等。ADAM 在精子運動及獲能環節發揮的作用是促進精子在女性生殖道內的運動，主要由ADAM3與其它ADAM 蛋白組成復合物促進精子與輸卵管上皮細胞表面的精子相關因子粘附使精子暫時儲存于UTJ和輸卵管峽部，而這一作用又是隨后精子進入輸卵管所必需的過程［11］。基因敲除動物模型證實ADAM3-／-雄性小鼠的精子由于從子宮運動至輸卵管的能力受損而不育［12］。

2.CatSper蛋白：是調節Ca2＋進入精子細胞主要的電壓門控通道，對于精子的運動功能非常重要。CatSper蛋白分布在精子主段的細胞膜上，人和小鼠等很多哺乳動物的CatSper通道由CatSper 1～4這4個蛋白組成，還有2 個輔助亞基CatSperβ和CatSperγ［8］。已經 證 實CatSper-／-雄 性 小 鼠 精 子 由于不能超活化從而不能穿透卵子細胞外基質導致雄性小鼠不育，人類CatSper1 基因突變會導致男性不育［13］。

3.Gelsolin蛋白：又稱凝溶膠蛋白，未獲能精子的Gelsolin蛋白位于人類精子尾部，當精子獲能時Ca2＋濃度增加導致Gelsolin蛋白構象發生改變從精子尾部移位至精子頭部暴露出纖維狀肌動蛋白結合位點。由于4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2（4，5））水平增加以及絡氨酸蛋白激酶SRC 家族的磷酸化使Gelsolin蛋白處于被抑制狀態，肌動蛋白因此發生聚合，引發精子超活化［7］。

4.附睪蛋白酶抑制因子（Eppin）：由人睪丸支持細胞和附睪上皮細胞分泌，表達于人類精子頭部頂體區和鞭毛，頂體反應后表達于赤道區和尾部。精子表面Eppin與乳鐵蛋白（LTF）和凝集素（Clus-terin）形成復合物，射精時精囊腺分泌的精囊蛋白（SEMG）結合到Eppin蛋白復合物上發揮Eppin的功能［14］。Eppin的功能有：（1）與SEMG1結合調節精子表面前列腺特異抗原（PSA）的酶活性；（2）對精子產生抗菌保護；（3）作為SEMG1受體與SEMG1結合抑制精子運動。其分子機制是SEMG1 與Eppin結合后會抑制或逆轉精子細胞內堿性化水平，從而抑制Ca2＋攝入，導致精子前向運動能力喪失［15］。當精液射出后精漿中的PSA 水解SEMG1隨后精子獲得前向運動能力。Eppin抗體與Eppin結合后會抑制細胞內Ca2＋濃度的增加阻斷頂體反應的發生［16］。

5.表皮生長因子受體（EGFR）：表達于人類精子質膜上，可以直接被其配體表皮生長因子（EGF）激活，也可被蛋白激酶A（PKA）間接激活，或者由G 蛋白偶聯受體（GPCRs）反式激活。精子獲能時上述幾個因子激活EGFR，導致磷脂酶D（PLD）活化和肌動蛋白聚合［17］。

二、頂體反應

獲能的精子與卵母細胞相遇后，精子頂體在接觸到卵丘細胞時誘發了精子質膜與頂體外膜的融合，頂體內的各種酶被釋放出來將卵母細胞透明帶水解形成入卵通道，頂體內膜上的精卵識別和融合位點暴露，這一過程稱為頂體反應［6］。頂體反應是受精所必須經歷的過程，只有獲能且發生頂體反應的精子才能夠進入卵周間隙，和卵膜接觸、結合并最終融合。與頂體反應有關的人類精子功能蛋白質如下：

1.Gelsolin蛋白：在精子運動及獲能中發揮著重要作用，精子獲能后頂體反應發生前不久細胞內的Ca2＋濃度再次升高，激活了磷脂酶C（PLC），PLC將PIP2（4，5）水 解 使 與PIP2（4，5）結 合 的Gelsolin蛋 白被釋放入胞質中。此時游離的Gelsolin蛋白因脫磷酸作用被激活，活化的Gelsolin蛋白使纖維狀肌動蛋白分離從而誘發頂體反應［7，9］。

2.表皮生長因子受體（EGFR）：在獲能后期，EGFR 的進一步激活增加了細胞內的Ca2＋濃度，從而激活Gelsolin蛋白，導致纖維狀肌動蛋白分解，最終使頂體反應發生［7，9］。在體內，生理條件下精子蛋白激酶A（PKA）主要由HCO3-激活，而表皮生長因子（EGF）以及G 蛋白偶聯受體（GPCRs）則由女性生殖道的生理成分血管緊張素Ⅱ或者溶血磷脂酸激活［17］。

3.分泌性肌動蛋白結合蛋白（SABP）：最初是從人精漿分離出來，表達于人類精子尾部中段。SABP可以和肌動蛋白結合起到類似抗肌動蛋白抗體的作用，從而抑制精子獲能和頂體反應。已有研究顯示少弱精子癥患者SABP表達量明顯高于正常對照組［18］，而反復IVF-ET 失敗患者與正常生育對照組的精子蛋白質表達分析顯示，IVF-ET 反復失敗患者的SABP表達也明顯高于對照組。

三、精子與卵母細胞透明帶結合

人卵母細胞透明帶由4 種糖蛋白（ZP1、ZP2、ZP3、ZP4）組成［19］，構成了精卵受精過程的屏障。頂體反應發生后、形成入卵通道之前，精子需要和透明帶結合形成一種穩定的狀態，這種狀態對于精子隨后溶解透明帶是十分必要的，精子頭部的蛋白是形成該狀態的關鍵分子。與精卵結合有關的人類精子功能蛋白質如下：

1.富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP）：CRISP家族成員都含有16 個保守的半胱氨酸殘基，其中10個聚集在C 末端。CRISP-1以雄激素依賴的方式由附睪合成，分布于頂體反應精子的赤道區。人CRISP1蛋白（hCRISP1）是一種多功能蛋白，通過抗CRISP1 抗體和重組CRISP1 蛋白作用發現hCRISP1可以與人卵母細胞透明帶ZP3 特異結合［20］。

2.熱休克蛋白A2（HSPA2）：人睪丸特異HSP70蛋白異構體，是一種分子伴侶。研究發現該分子伴侶與男性不育相關，在介導精卵識別中發揮重要作用［21］。作為分子伴侶，HSPA2 并不是直接參與人類精子與透明帶的結合，而是通過與精子粘附分子1（SPAM1）和芳香基硫酸酯酶（ARSA）組合成多聚透明帶受體復合物，間接參與精子和透明帶的相互作用［22］。SPAM1具有透明質酸酶活性，可以分解卵丘復合物，ARSA 則可以直接粘附到ZP上，二者通過HSPA2 的調配來發揮各自的作用。如果沒有HSPA2，作為透明質酸酶受體的SPAM1和ZP受體的ARSA 都不能發揮作用，從而無法完成受精［22-23］。

四、精卵融合

精子穿過透明帶后進入卵周間隙，此時精卵膜融合是精子頭部內的遺傳物質輸送入卵母細胞內的關鍵因素，也是受精成功最重要的一步。精卵膜融合是由精子膜和卵膜表面互補配對的特異性蛋白質分子介導的。與精卵融合有關的人類精子功能蛋白質如下：

1.ADAM 家族：精卵融合中主要由ADAM2與其它 ADAM 蛋白形成的復合物發揮作用。ADAM2是卵母細胞表面整合素α6β1 的受體，通過二者的相互作用增強精子質膜與卵母細胞質膜的粘附，ADAM2-／-雄性小鼠表現出精卵膜粘附和融合缺陷［24］。含有ADAM2和ADAM3的復合物在體外同樣可以促進精卵相互作用。

2.IZUMO：屬于I型膜蛋白免疫球蛋白超家族，具有一個細胞外Ig區和一個N 末端區。這一家族由四個蛋白組成，從1到4命名，在N 末端區有顯著同源性，因此也稱為IZUMO 區。IZUMO1、2和3僅表達于人睪丸表面，而4是可溶性蛋白可以在人睪丸和其他組織表達。精卵融合必需的IZUMO1在女性生殖道內運動和受精時表達于精子的不同部位，頂體反應時IZUMO1會從精子頭部前區重新分布到將要發生融合的部位，也就是赤道區［25］。卵母細胞表面IZUMO1 的受體 是JUNO（葉酸受體4，以羅馬的婚姻和生育女神JUNO 命名），二者互補結合后介導精卵膜融合。IZUMO1和JUNO 是到目前為止唯一確定的精卵融合必需的 配 對 受 體［26］。 已 有 動 物 實 驗 結 果 表 明，IZUMO1-／-雄性小鼠可以正常交配和射精并形成陰道栓，但是由于精子不能與卵母細胞融合，導致雄鼠完全不育［25］。JUNO 在未受精卵母細胞表面高度表達，JUNO-／-雌性小鼠也由于精卵融合障礙而絕對不孕［26］。

3.富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP）：人CRISP1蛋白（hCRISP1）不僅介導精子與卵子透明帶結合，還通過與卵母細胞表面的互補位點結合在精卵融合中發揮作用［20］。CRISP-2 則是以非雄激素依賴的方式表達于睪丸，它是一種頂體內蛋白，頂體反應后仍然存在于精子表面，在隨后的精卵融合中起作用。抗人CRISP-2蛋白抗體可以抑制精子穿入卵母細胞。CRISP-1 和CRISP-2 與卵母細胞表面共同的互補位點結合，協同作用確保成功受精［27］。

4.ERp57：主要來源于人類睪丸組織生精細胞胞質以及睪丸間質細胞，睪丸支持細胞也少量產生。ERp57分泌后結合于人類精子頂體和尾部，頂體反應后移位至赤道區。精子獲能時ERp57蛋白發生了翻譯后修飾。用抗體阻斷ERp57可以劑量依賴的方式顯著抑制人類精子穿透去透明帶倉鼠卵母細胞的能力。ERp57的表達水平也與生殖能力相關，IUI周期妊娠率高的捐精者其精子蛋白ERp57 的表達高于周期妊娠率低者［28］。IVF 成功率較低的患者其ERp57表達水平明顯低于成功率高的患者以及已生育的捐精者。這些結果顯示ERp57是人類精子頂體蛋白組成之一，在精卵融合中發揮至關重要的作用［29］。

綜上所述，人類受精這一過程受到多種精子蛋白質分子的調控，但大部分蛋白質分子在精子運動活力、獲能、頂體反應以及精卵融合等環節中的具體作用機理仍不是非常清楚。隨著蛋白質組學研究技術的應用，發現了一些與人類精子受精相關的功能蛋白質［30］，比如臨床研究中發現一些和生殖結局明確相關的蛋白質分子［28-29］，一些蛋白質分子還可以對某些疾病進行無創性診斷［30］。目前，評估男性生殖能力的方法仍然以檢測精子活力、濃度、形態等常規精液分析為主，但是這一傳統的評估方法并不能準確反映男性的真實生育力，因此會給患者帶來不必要的時間、經濟以及心理壓力。個體間的受精能力差異是由受精相關的蛋白質分子組成不同導致的［31］，如果能夠檢測出這些與受精能力相關的蛋白質分子，建立生物標記物檢測方法，對精子受精能力進行有效評價并對生殖結局進行預測，將對男性不育的臨床診斷和治療帶來極大的便利。

［1］ Bhasin S.Approach to the infertile man［J］.J Clin Endocrinol Metab，2007，92：1995-2004.

［2］ Thacker S，Yadav SP，Sharma RK，et al.Evaluation of sperm proteins in infertile men：aproteomic approach［J］.Fertil Steril，2011，95：2745-2748.

［3］ Rahman MS，Lee JS，Kwon WS，et al.Sperm proteomics：road to male fertility and contraception［J］.Int J Endocrinol，2013，2013：360986.

［4］ Amaral A，Castillo J，Ramalho-Santos J，et al.The combined human sperm proteome：cellular pathways and implications for basic and clinical science［J］.Hum Reprod Update，2014，20：40-62.

［5］ Ashrafzadeh A，Karsani SA，Nathan S.Mammalian sperm fertility related proteins［J］.Int J Med Sci，2013，10：1649-1657.

［6］ Ikawa M，Inoue N，Benham AM，et al.Fertilization：a sperm’s journey to and interaction with the oocyte［J］.J Clin Invest，2010，120：984-994.

［7］ Finkelstein M，Etkovitz N，Breitbart H.Role and regulation of sperm gelsolin prior to fertilization［J］.J Biol Chem，2010，285：39702-39709.

［8］ Rahman MS，Kwon WS，Pang MG.Calcium influx and male fertility in the context of the sperm proteome：an update［J］.Biomed Res Int，2014，2014：841615.

［9］ Finkelstein M，Megnagi B，Ickowicz D，et al.Regulation of sperm motility by PIP2（4，5）and actin polymerization［J］.Dev Biol，2013，381：62-72.

［10］ Cho C.Testicular and epididymal ADAMs：expression and function during fertilization［J］.Nat Rev Urol，2012，9：550-560.

［11］ Tokuhiro K，Ikawa M，Benham AM，et al.Protein disulfide isomerase homolog PDILT is required for quality control of sperm membrane protein ADAM3and male fertility［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109：3850-3855.

［12］ Yamaguchi R，Muro Y，Isotani A，et al.Disruption of ADAM3impairs the migration of sperm into oviduct in mouse［J］.Biol Reprod，2009，81：142-146.

［13］ Avenarius MR，Hildebrand MS，Zhang Y，et al.Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1channel protein［J］.Am J Hum Genet，2009，84：505-510.

［14］ O’Rand MG，Widgren EE，Hamil KG，et al.Functional studies of eppin ［J］.Biochem Soc Trans，2011，39：1447-1449.

［15］ O’Rand MG，Widgren EE.Loss of calcium in human spermatozoa via EPPIN，the semenogelin receptor［J］.Biol Reprod，2012，86：55.

［16］ Zhang J，Ding X，Bian Z，et al.The effect of anti-eppin antibodies on ionophore A23187-induced calcium influx and acrosome reaction of human spermatozoa［J］.Hum Reprod，2010，25：29-36.

［17］ Breitbart H，Etkovitz N.Role and regulation of EGFR in actin remodeling in sperm capacitation and the acrosome reaction［J］.Asian J Androl，2011，13：106-110.

［18］ CapkováJ，Elzeinová F，Novák P.Increased expression of secretory actin-binding protein on human spermatozoa is associated with poor semen quality［J］.Hum Reprod，2007，22：1396-1404.

［19］ Avella MA，Xiong B，Dean J.The molecular basis of gamete recognition in mice and humans［J］.Mol Hum Reprod，2013，19：279-289.

［20］ Maldera JA，Weigel Mu?oz M，Chirinos M，et al.Human fertilization：epididymal hCRISP1 mediates sperm-zona pellucida binding through its interaction with ZP3［J］.Mol Hum Reprod，2014，20：341-349.

［21］ Nixon B，Bromfield EG，Dun MD，et al.The role of the molecular chaperone heat shock protein A2 （HSPA2）in regulating human sperm-egg recognition［J］.Asian J Androl，2015，17：568-573.

［22］ Redgrove KA，Nixon B，Baker MA，et al.The molecular chaperone HSPA2 plays a key role in regulating the expression of sperm surface receptors that mediate sperm-egg

recognition［J］.PLoS One，2012，7：e50851.

［23］ Redgrove KA，Anderson AL，McLaughlin EA，et al.Investigation of the mechanisms by which the molecular chaperone HSPA2regulates the expression of sperm surface receptors involved in human sperm-oocyte recognition［J］.Mol Hum Reprod，2013，19：120-135.

［24］ Baessler KA，Lee Y，Sampson NS.Beta1integrin is an adhesion protein for sperm binding to eggs［J］.ACS Chem Biol，2009，4：357-366.

［25］ Klinovska K，Sebkova N，Dvorakova-Hortova K.Sperm-egg fusion：a molecular enigma of mammalian reproduction［J］.Int J Mol Sci，2014，15：10652-10668.

［26］ Bianchi E，Doe B，Goulding D，et al.Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization［J］.Nature，2014，508：483-487.

［27］ Cohen DJ，Maldera JA，Weigel Mu?oz M，et al.Cysteine-rich secretory proteins （CRISP）and their role in mammalian fertilization［J］.Biol Res，2011，44：135-138.

［28］ 張斌，卞增惠，蘇建堂.精子蛋白ERp57與宮腔內人工授精周期妊娠率相關性的初步分析［J］.中華男科學雜志，2009，15：354-356.

［29］ Zhang J，Wu J，Huo R，et al.ERp57is a potential biomarker for human fertilization capability［J］.Mol Hum Reprod，2007，13：633-639.

［30］ Heshmat SM，Mullen JB，Jarvi KA，et al.Seminal plasma lipocalin-type prostaglandin D synthase：a potential new marker for the diagnosis of obstructive azoospermia［J］.J Urol，2008，179：1077-1080.

［31］ Govindaraju A，Dogan S，Rodriguez-Osorio N，et al.Delivering value from sperm proteomics for fertility［J］.Cell Tissue Res，2012，349：783-793.