碘乳康口服溶液微生物限度檢查方法學驗證

張廣求劉文田祥學

（1黃岡市中心醫院藥劑科，湖北 黃岡 438000；2黃岡市食品藥品監督檢驗中心）

碘乳康口服溶液微生物限度檢查方法學驗證

張廣求1劉文1田祥學2

（1黃岡市中心醫院藥劑科，湖北 黃岡 438000；2黃岡市食品藥品監督檢驗中心）

目的：建立碘乳康口服溶液的微生物限度檢查方法。方法：按《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄微生物限度檢查法，進行碘乳康口服溶液的細菌、霉菌、酵母菌及控制菌檢查方法驗證，各進行3次獨立的平行試驗，分別計算各試驗菌的回收率。結果：采用常規法對5種陽性對照菌株進行測定，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均小于70%；采用培養基稀釋法（0.5 mL/皿），5種陽性對照菌株的回收率均大于70%；控制菌大腸埃希菌采用常規法可檢出。結論：碘乳康口服溶液的微生物限度檢查中，細菌、霉菌及酵母菌計數可采用培養基稀釋法（0.5 mL/皿），大腸埃希菌檢查采用常規法。

碘乳康口服溶液；微生物限度；方法學驗證試驗；回收率

微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要組成部分，《中華人民共和國藥典》2010年版規定，當建立藥品的微生物限度檢查方法時，應進行方法學驗證[1]。碘乳康口服溶液是黃岡市中心醫院的自制制劑（批準文號：鄂藥制字H20110227），主要由碘、碘化鉀組成，用于乳腺增生癥，安全性好，臨床療效顯著。由于碘具強有力的消毒防腐作用，能殺死細菌、霉菌、病毒[2]，文獻[3]亦證實碘注射液中的碘有抑菌作用，為保證制劑質量，本研究參考有關文獻[4-6]，并進行多次試驗，建立了適合該制劑的微生物限度檢查方法，保證了方法的科學性和檢驗結果的準確可靠。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SZK202凈化工作臺（蚌埠凈化設備廠）；YC-875S醫用凈化工作臺（蘇州凈化設備廠）；高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司）；KWY-100型電熱干燥箱（武漢市武昌實驗儀器廠）；DG-1多功能恒溫箱（上海醫療器械修理廠）；HHB11420電熱恒溫培養箱（湖北省黃石市醫療器械廠）；XK97-A菌落計數器（江蘇省姜堰市新康儀器廠）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，大腸埃希菌CMCC（B）44102，枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F） 98003均為第0代冷凍保藏菌株，購自湖北省食品藥品監督檢驗研究院。

1.3 培養基

營養瓊脂培養基、改良馬丁培養基、營養肉湯培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基均由北京三藥科技開發公司生產；改良馬丁瓊脂培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（MUG）均由北京奧博星生物技術有限責任公司生產；蛋白胨、膽鹽乳糖培養基均由武漢市天益生化試劑有限公司生產。以上培養基的適用性檢查均符合《中華人民共和國藥典》2010年版規定，可用于微生物限度檢查。

1.4 試藥、試液、稀釋液、樣品

氯化鈉（中鹽宏博集團云夢云虹制藥有限公司，批號：20130710）；0.9%無菌氯化鈉溶液、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、靛基質試液（均按《中華人民共和國藥典》方法配制[1]）；碘乳康口服溶液（批號：141012，141121，150129，黃岡市中心醫院自制）。

2 方法與結果

2.1 供試液的制備

取樣品2瓶共10 mL，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（稀釋液）至100 mL，搖勻，制成1∶10的供試液，備用。

2.2 陽性對照菌液的制備

取經35℃培養18～ 24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物各1 mL，分別加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，按10倍稀釋法稀釋至含菌數為50～ 100 cfu/mL的菌懸液，作活菌計數備用。

取經25℃培養24 h的白色念珠菌改良馬丁培養物1 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液9 mL，按10倍稀釋法稀釋至含菌數為50～ 100 cfu/mL的菌懸液，作活菌計數備用。

取經25℃培養7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養物，加0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL，將孢子洗脫，用管口帶有薄無菌脫脂棉的無菌毛細吸管，吸取孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至含孢子數為50～ 100 cfu/mL的孢子懸液，作活菌計數備用。

各菌懸液均采用平皿計數法測定活菌數，每株試驗菌平行制備2個平皿，結果見表1。

驗證細菌、霉菌及酵母菌計數法時，加菌量為50～ 100 cfu；驗證控制菌檢查法時，加菌量為10～ 100 cfu。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的建立和驗證

2.3.1 回收率測定

2.3.1.1 試驗組 ①常規法：取供試液1 mL和含50～ 100 cfu試驗菌的菌懸液，注入同一平皿中，立即傾注約15 mL溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，凝固后倒置，按規定溫度培養，細菌培養24～ 48 h，霉菌及酵母菌培養48～72 h，觀察結果，點計菌落數。②培養基稀釋法：取供試液，采用0.2 mL/皿和0.5 mL/皿法，再加入各試驗菌50～ 100 cfu，其余操作同常規法。

表1 細菌、霉菌及酵母菌計數結果 （cfu/mL）

2.3.1.2 菌液組 分別取各試驗菌50～ 100 cfu注入平皿中，注入相應培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，培養，點計菌落數，以測定每一菌株加入的試驗菌數。

2.3.1.3 樣品對照組 除不加菌液外，其余操作同試驗組，以測定樣品的本底菌數。

2.3.1.4 稀釋液對照組 除以稀釋液代替供試液外，其余操作同試驗組，以考察供試液制備過程中對微生物影響的程度。

2.3.1.5 回收率計算 各進行3次獨立的平行試驗，分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

試驗組的菌回收率（%）=（試驗組的平均菌落數 － 樣品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數 ×100%。

2.3.2 方法的確定

2.3.2.1 常規法 各試驗菌回收率試驗結果見表2。由表2可知，常規法各試驗菌回收率均低于70%，即碘乳康口服溶液在該檢驗條件下，有不同程度的抑菌作用，不能采用常規法進行細菌、霉菌及酵母菌計數。

表2 常規法各試驗菌回收率試驗結果 （%）

2.3.2.2 培養基稀釋法 0.2 mL/皿和0.5 mL/皿法各試驗菌的回收率試驗結果見表3。由表3可見，上述5種試驗菌的菌回收率 0.2 mL/皿和0.5 mL/皿法均大于70%，且0.2 mL/皿和0.5 mL/皿法的測定結果基本一致。培養基稀釋法中的0.5 mL/皿即可消除樣品的抑菌活性，為減少測定誤差，將0.5 mL/皿法作為樣品的細菌計數方法，經方法學驗證試驗成立。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 菌株選擇碘乳康口服溶液為化學藥口服液體制劑，按照《中華人民共和國藥典》2010年版[1]附錄微生物限度檢查法中的有關控制菌檢查方法，應檢查大腸埃希菌，陰性對照菌為金黃色葡萄球菌。

表3 培養基稀釋法各試驗菌回收率試驗結果 （%）

2.4.2 驗證方法與結果取 100 mL膽鹽乳糖培養基 6份，2份分別加入10 mL供試液及 1 mL 10～ 100 cfu/mL大腸埃希菌菌懸液，作為試驗組；2份分別加入 10 mL供試液及 1 mL 10～100 cfu/mL金黃色葡萄球菌菌懸液，作為陰性菌對照組，以驗證大腸埃希菌檢查方法的專屬性；2份分別加入稀釋劑10 mL，作為陰性對照組，置35℃培養24 h。取上述培養物0.2 mL，接種至含MUG培養基5 mL的試管中培養，于5，24 h在366 nm波長紫外光下觀察有無熒光反應。沿培養管的管壁加入靛基質試液數滴，觀察液面是否呈玫瑰紅色，結果見表4。

表4 控制菌檢查法驗證結果

試驗結果顯示，試驗組3批樣品均檢出大腸埃希菌，陰性對照菌金黃色葡萄球菌均未檢出。表明樣品的控制菌檢查方法按常規法，經方法學驗證試驗成立。

2.5 3批樣品的微生物限度和控制菌檢查

根據方法學驗證試驗結果，碘乳康口服溶液的微生物限度檢查法可采用下列方法：細菌、霉菌及酵母菌計數可采用培養基稀釋法（0.5 mL/皿），大腸埃希菌檢查采用常規法。3批樣品的微生物限度檢查結果見表5。

3 討論

3.1 碘乳康口服溶液有一定程度的抑菌作用，常規法無法真實反映溶液被污染的情況。采用培養基稀釋法（0.5 mL/皿），碘在平皿中的濃度只有5.67×10-6g/mL，能較好地消除抑菌成分碘的干擾，試驗菌株的回收率均符合要求。培養基稀釋法可稀釋藥品中的抑菌成分，減少其對細菌、霉菌及酵母菌生長的影響，較其他方法簡便、經濟，但該法僅限于有弱抑菌作用的藥品，不適用于含較強抑菌作用藥品的微生物限度檢查。筆者曾采用薄膜過濾法，也獲得較理想的結果，但薄膜過濾法操作較繁瑣、費時。對于抑菌作用較強的藥品的微生物限度檢查，薄膜過濾法是一種檢出率較高、結果較準確可靠的方法[8]。

表5 3批樣品微生物限度檢查結果 （cfu/mL）

3.2 制備陽性對照菌液的含菌數應控制在 50～100 cfu，過多或過少時，回收率測定結果會產生較大的誤差。供試液和陽性對照菌液分別注入平皿后，應立即傾入培養基混勻，試驗時，最好兩人配合操作。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄107-116.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知（化學藥和生物制品卷）[M].北京：人民衛生出版社，2005：859.

[3] 張廣求.碘注射液無菌檢查方法學驗證[J].中國醫院藥學雜志，2010：30（2）：165-166.

[4] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規程[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-407.

[5] 杜建紅，張國慶，方晨，等.水合氯醛合劑微生物限度檢查的驗證[J].中國執業藥師，2014：11（5）：21-23.

[6] 張廣求.十九味赤芍膠囊微生物限度檢查方法的建立[J].醫藥導報，2009，28（8）：1075-1076.

Methodology Validation of Microbial Limit Test for Dianrukang Oral Solution

Zhang Guangqiu1，Liu Wen1，Tian Xiangxue2（1 Pharmacy Department of Huanggang Central Hospital，Hubei Huanggang 438000,China；2 The Center for Food and Drug Control of Huanggang City）

Objective：To establish the method of microbial limit test for dianrukang oral solution.Methods：According to the method of microbial limit test set forth in the Volume II Appendix of China Pharmacopoeia（2010 edition）,the test method validations were carried out for bacteria,mold,yeast and the control bacteria for dianrukang oral solution.For each test three parallel experiments were performed independently and the recovery rate of each tested organism was calculated.Results：Using the conventional method for the tests of five kinds of positive control strains,the recovery rates of Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Bacillus subtilis,Candida albicans and Aspergillus niger were all less than 70%,using medium dilution method （0.5 mL/plate）,the recovery rates of the above mentioned strains were all greater than 70%,and the control bacteria of Escherichia coli can be detected by conventional method.Conclusion：In the microbial limit test of dianrukang oral solution,culture medium dilution method （0.5 mL/plate）can be used for bacteria,mold and yeast counting and the conventional method can be used for the test of Escherichia coli.

Dianrukang Oral Solution；Microbial Limit；Methodology Validation Test；Recovery Rate

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.08.003

2015-04-23）

張廣求,男，副主任藥師。研究方向：醫院藥學、藥物分析。通訊作者E-mail：ccnpa@163.com