哺乳動物性別決定相關基因及其調控機制

李簫，翁靜

（首都醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院，2.基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗室，北京 100069）

哺乳動物個體性別雖在受精時就已決定，但直到胚胎發(fā)育到一定階段，具有兩性分化潛能的原始性腺才分化為睪丸或卵巢，而次級性別差異（第二性征）則在性腺分化并獲得內分泌功能（性成熟）后才出現(xiàn)。這一性別決定過程的正常進行有賴于多種性別決定基因的相互作用，如與原始性腺發(fā)育有關的SF1、Wilms腫瘤易感基因（WT1），與睪丸發(fā)育有關的SRY、SOX9 基因，與卵巢發(fā)育有關的WNT4、RSPO1基因，等等。它們處在基因調控網絡的上下游，通過相互協(xié)同或拮抗而發(fā)揮作用。隨著越來越多重要的調節(jié)基因被發(fā)現(xiàn)，對決定哺乳動物性別的基因調控網絡的認識也在不斷豐富。

一、與原始性腺（雙向分化潛能）發(fā)育有關基因

1.SF1：SF1編碼類固醇生成因子-1（SF1），其表達先于Y 染色體性別決定基因（SRY），與性腺中支持細胞和間質細胞的形成有關，并介導SRY 表達上調［1］。Sf1基因缺失的小鼠性腺及腎上腺均發(fā)育不全，性腺的發(fā)育在早期未分化階段即停止。故XY 小鼠體內Müller管不退化而分化為子宮、輸卵管及陰道上段，使其發(fā)生完全性反轉［2］。在性腺發(fā)育后期，SF1可在睪丸支持細胞和睪丸間質細胞中表達，產物SF1 協(xié)同SOX9 調節(jié)抗Müller管激素（AMH）基因及其它性腺發(fā)育相關基因的表達水平。有研究表明SF1可協(xié)同SRY 結合于SOX9的特定序列，上調SOX9 表達，產物SOX9 則取代SRY，與SF1進一步上調自身基因的表達水平，即SOX9的 正 反 饋 調 節(jié)［3］。在 人 類，SF1 突 變 導 致46，XY 個體性腺發(fā)育不全，還與46，XX 個體的原發(fā)性卵巢功能不全有關［4］。

2.WT1：WT1編碼一類鋅指結構的轉錄因子。在某些性腺相關的綜合征患者體內可檢測到WT1突變，如WAGR 綜合征（Wilms瘤、無虹膜、泌尿生殖器畸形及智力低下）、Denys-Drash綜合征（性腺畸形和腎衰竭）、Frasier綜合征（46，XY 個體性腺發(fā)育不全）［5］。Wt1突變的小鼠腎臟和性腺不發(fā)育，通常在胚胎階段即死于心臟缺陷。

在WT1轉錄的RNA 剪切過程中，由于剪切位點不同而導致第3、4 鋅指結構間3 個氨基酸殘基（KTS，即賴氨酸、蘇氨酸、絲氨酸）的嵌入或缺失，形成＋KTS 和-KTS 兩種WT1 蛋白亞型，它們在胚胎形成過程中發(fā)揮的作用不同。-KTS亞型可結合于SRY 啟動子而反式激活SRY，也可結合于SF1的啟動子激活SF1 表達［6］，表明SF1 可能是WT1的靶基因。＋KTS 亞型的作用可能是調節(jié)SRY 轉錄水平，另有證據表明該亞型可協(xié)同SF1增強Amh基因表達，從而限制Müller管發(fā)育［7］。

3.LIM 同源框基因-9（Lhx9）：Lhx9缺失的小鼠，其胚胎時期原始生殖細胞可正常遷移，但生殖腺嵴中體細胞無法增殖，性腺形成受阻，由于缺乏睪酮和AMH，XY 小鼠表型為雌性。研究表明，缺少LHX9的生殖腺嵴中Sf1 表達水平極低，提示Lhx9可能是Sf1的上游基因［8］。體外實驗還顯示LHX9 可協(xié)同WT1 結合并反式激活Sf1 啟動子［6］。Gata4敲除的胚胎中，LHX9水平顯著降低，提示Gata4為Lhx9的表達所必需，為Lhx9的上游基因［9］。Lhx9在人類早期性腺發(fā)育中的作用尚不明確。

4.M33：M33在妊娠第7周即在人類胚胎的生殖腺嵴中表達。在大多數(shù)XY 小鼠體內，M33基因缺失導致性反轉；在XX 小鼠則體現(xiàn)為卵巢的體積減小或缺失。研究發(fā)現(xiàn)，M33 敲除的XY 小鼠，其生殖細胞在胚胎期提早進入減數(shù)分裂階段；而雌性突變體減小的卵巢內生殖細胞數(shù)目明顯減少且染色體聯(lián)會異常的卵母細胞比例增高，提示M33蛋白對雄性生殖細胞減數(shù)分裂阻滯、雌性生殖細胞同源染色體正常聯(lián)會及染色體穩(wěn)定性都有重要作用［10］。人類病例中，在1 名核型為46，XY，但內外生殖器官的表型均為女性的患者體內檢測到M33編碼區(qū)突變。由于M33缺失在兩性都可引起明顯的性腺缺陷，說明M33作用時間在性別決定前的早期性腺發(fā)育階段［11］，與其表達時間相一致。最近的研究發(fā)現(xiàn)，M33缺失的XY 小鼠性腺內幾乎檢測不到Sry表達，但若通過轉基因方法使其表達Sry、Sox9 則可糾正性反轉，提示M33可能作用于Sry 上游調節(jié)其表達［12］。

5.Insr、Igfr1：Insr和Igfr1分別編碼胰島素受體（INSR）和類胰島素生長因子受體-1（IGFR1），二者對小鼠腎上腺及生殖器的發(fā)育和初級性別決定都是不可或缺的。INS／IGF 信號通路的缺損在原始性腺中導致性別分化之前體細胞的增殖速率下降，同時伴隨數(shù)百種性腺發(fā)育相關基因的表達下調?？偟膩碚f，缺乏功能性INS／IGF 信號的胚胎表現(xiàn)出：（1）腎上腺皮質完全不發(fā)育；（2）XY 性腺性別反轉；（3）卵巢分化延遲，即XX 和XY 性腺未分化狀態(tài)延長。

Insr／Igfr1雙敲除 的XY 性 腺 中，Sry 表 達 水平下降和表達時間延遲導致其下游基因Sox9表達水平也明顯降低，SOX9無法達到使睪丸支持細胞形成所需閾值，進一步導致睪丸間質細胞分化失敗、類固醇無法生成。有研究發(fā)現(xiàn)，Sry 表達啟動后，初級性索細胞內立刻開始糖原累積，這一能量儲備過程與Sox9 上調、睪丸索形成以至睪丸整體發(fā)育關系密切，而該過程依賴于INS 和IGF，故在Insr／Igfr1雙敲除的XY 性腺中，多種糖原合成所需酶類水平均下降，這是睪丸發(fā)育缺失的另一原因。

Insr和Igfr1基因雙敲除的XX 性腺中，某些卵巢決定因子缺失（如FOXL2）及相關基因表達下降（如Wnt4），與視黃酸合成相關的酶水平也下降（細胞進入減數(shù)分裂期需視黃酸誘導），共同導致卵巢分化延遲至胚胎第16.5天（E 16.5）［13］。

二、睪丸發(fā)育相關基因

1.SRY：SRY 是Y 染色體上決定雄性性別的基因片段，在性別決定中起開關作用。人類SRY 位于Yp11.3。SRY 編碼的蛋白質含有DNA 結合域（高泳動類非組蛋白盒，HMG-box），該結構域介導SRY 進入胞核，其非極性蛋白質側鏈嵌入DNA 特定區(qū)域α-螺旋的小溝與其結合并使之彎曲60°～85°，反式激活所結合的DNA。幾乎所有導致XY個體性反轉的SRY 突變都存在于HMG-box內，且HMG-box在哺乳動物種系間具有高度保守性，表明SRY 蛋白除HMG-box以外的部分在性別決定中只發(fā)揮次要作用，如維持SRY 蛋白構象穩(wěn)定性、促進SRY 與DNA 的結合等［14］。SRY 基因對睪丸發(fā)育的啟動有賴于其下游一系列基因的表達。目前確定SRY 通過與Sox9 的TESCO 序列結合反式激活Sox9，故SOX9 是SRY 的 靶 基 因［15-16］。此 外，WT1也可能是SRY 的靶基因。

人類胚胎內SRY 在E41開始表達，SRY 的表達時間和表達水平關系到其功能的行使，表達過遲將導致睪丸發(fā)育不良，表達水平只有達到閾值才能正常誘導睪丸的發(fā)育。

2.GATA4 和FOG2：Gata4 編 碼 的 蛋 白GATA4含有兩個鋅指結構，在識別結合DNA、穩(wěn)定蛋白質-DNA 和蛋白質-蛋白質之間相互作用方面發(fā)揮重要作用。GATA4 與一些蛋白質如SF1，F(xiàn)OG2，WT1等協(xié)同作用，調節(jié)SRY、SOX9、AMH等性別決定基因的表達［17-18］。

實驗顯示，小鼠體內GATA4氨基端鋅指結構突變阻礙了GATA4與FOG2相互作用，導致睪丸發(fā)育嚴重畸形［19］。在人類，最近的一例家族病例顯示，GATA4雜合型功能缺失性突變導致該家族3名46，XY 個體發(fā)生性發(fā)育疾病，表現(xiàn)為外陰性別不明或陰莖長度縮短。研究發(fā)現(xiàn)這一突變蛋白無法結合并激活AMH 的啟動子，也無法與FOG2結合發(fā)揮協(xié)同作用［20］。

新的研究發(fā)現(xiàn)，Gata4不僅影響睪丸發(fā)育，對于生殖腺嵴形成更是不可或缺，它在原始性腺增厚前即在體腔上皮細胞內表達。Gata4缺陷的小鼠胚胎無法形成原始性腺，體腔上皮仍停留在未分化的單層上皮階段［9］。

3.SOX9，SOX8，SOX10：SOX 基因家族編碼的轉錄因子均有一保守基序HMG-box，可與DNA序列特異性結合。哺乳動物SRY 基因即為該家族成 員，此 外 家 族 中 另3 名 成 員，SOX9、SOX8、SOX10，也在XY 個體的性腺中表達。

在小鼠胚胎，Sox9起初在兩性生殖腺嵴中低水平表達，但Sry 表達后，Sox9在睪丸支持細胞中的表達水平即迅速上升。已證明SRY 可啟動SOX9表達，但有實驗表明Sox9 可在Sry 缺席的情況下啟動轉錄，說明另有激活Sox9 表達的途徑。觀察結果顯示含有Dax1無效等位基因或FGF9突變蛋白的小鼠因體內Sox9 表達水平下降而導致性反轉，但Sry 的表達水平卻與野生型小鼠相仿［21-22］，說明DAX1 和FGF9 可能也有上調Sox9 表達的作用。

關于SOX9 作用的下游靶基因，研究顯示SOX9與SF1共同調節(jié)Amh基因的表達，前者啟動Amh轉錄，后者主要調節(jié)其轉錄水平。體外實驗還發(fā)現(xiàn)Sf1在睪丸支持細胞中表達的維持及Vanin-1（Vanin-1編碼泛酰巰基乙胺酶，其產物可保護原始生殖細胞免受氧化應激的傷害）的表達也有賴于SOX9，故這兩種基因也可能是SOX9的靶基因。

動物實驗中，條件敲除Sox9基因的小鼠XY 胚胎出現(xiàn)卵巢發(fā)育，而過度表達Sox9的XX 胚胎出現(xiàn)睪丸發(fā)育，說明SOX9的存在及表達水平在性別決定中的重要性［3］。人類病例顯示，包含SOX9的序列或SOX9上游序列重復導致XX 個體出現(xiàn)睪丸，SOX9上游基因易位導致XY 和XX 個體的性反轉，SOX9上游序列缺失導致XY 個體出現(xiàn)卵巢發(fā)育、男性性腺發(fā)育不全、外陰性別模糊等癥狀。病例分析顯示，人類SOX9基因的睪丸特有調控元件較小鼠復雜得多［23］。雖然SOX9在睪丸發(fā)育過程中作用關鍵，但其對睪丸支持細胞的維持和睪丸索的完整性似乎作用甚微，猜想同族因子SOX8 及SOX10或可功能性替代SOX9。

小鼠體內Sox8基因于E13.5d 時在睪丸索內的睪丸支持細胞中表達。研究顯示，Sox8-／-雄性小鼠生育力降低，提示Sox8 對雄性生育力的維持有重要作用。還有實驗表明SOX8 可與SF1 協(xié)同作用，結合于Amh的啟動子激活其轉錄，這支持了在睪丸發(fā)育中SOX8和SOX9功能重復這一假設，發(fā)生原因可能是兩者來源相同［24］。

Sox10基因無效表達的XY 小鼠并未觀察到睪丸異常，但其在XX 小鼠性腺內的過度表達卻可誘導睪丸發(fā)育，顯示Sox10雖不是睪丸發(fā)育的必需基因，但仍可作為睪丸決定基因發(fā)揮作用［25］。此猜想在人類病例中得到支持，46，XX 睪丸化患者體內檢測到包含SOX10在內的基因序列重復［26］。病因不排除與該重復序列內其它基因有關，但SOX10 仍是最有可能的候選致病基因。

4.DMRT1：DMRT1 持續(xù)在睪丸支持細胞中表達。在人類和小鼠，DMRT1 對XY 個體出生后睪丸支持細胞和生殖細胞的維持不可或缺。Dmrt1無效表達的小鼠在胚胎期性腺可正常發(fā)育，但在出生后2日即因生殖細胞雌性化而嚴重損害睪丸發(fā)育。小鼠睪丸支持細胞中DMRT1 缺失使Foxl2表達上調，引起睪丸支持細胞重編程而轉變?yōu)轭w粒細胞，卵泡膜細胞也隨之形成，這些細胞分泌的雌激素最終導致生殖細胞雌性化［27］。相似地，在人類病例中，含有半合子DMRT1基因的46，XY 個體表現(xiàn)出睪丸發(fā)育不良。但因涉及該基因的病例較少，其對人類睪丸發(fā)育的調控機制尚未闡明［28］。

5.FGF9：FGF9 編碼纖維母細胞生長因子-9（FGF9），在細胞增殖、存活、遷移、分化等不同階段均發(fā)揮作用。

Fgf9無效表達的XY 小鼠發(fā)生性反轉且睪丸支持細胞發(fā)育受損。曾經認為發(fā)生機制是FGF9缺失時Sox9 的表達無法維持，睪丸支持細胞分化異常，導致睪丸無法正常發(fā)育，體細胞表達卵巢發(fā)育相關基因［22］。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gf9、Sox9、Wnt4之間存在更復雜的相互作用：Fgf9 及其受體Fgfr2缺失的XY 小鼠性腺內Wnt4 的表達激活，且Fgf9、Wnt4均缺失的XY 小鼠睪丸仍可發(fā)育，表明FGF9雖可抑制卵巢發(fā)育相關信號通路，但對Sox9表達的維持并無直接作用［29］。

FGF9作為胚胎睪丸中抑制減數(shù)分裂發(fā)生的重要蛋白，與減數(shù)分裂誘導劑視黃酸（RA）之間存在明顯的拮抗作用。FGF9 直接作用于生殖細胞，通過維持全能性標記物OCT4和SOX2的表達，降低雄性生殖細胞對RA 的敏感性［30］。

6.Six1＆Six4：Six1、Six4基因編碼同源異型蛋白Six1、Six4，兩種蛋白均缺失的XY 小鼠性腺發(fā)生性反轉并無法激活Sry 轉錄，突變性腺中還觀察到前體細胞數(shù)目減少及性腺體積減小。

目前認為Six1／Six4有Sf1、Fog2兩個下游靶基因，故對小鼠性腺的影響是由兩個不同的轉錄調控網絡調節(jié)的。一方面，Six1／Six4反式激活Sf1，Sf1在Sry 表達啟動前參與調控性腺中前體細胞的生長，故可決定性腺體積；另一方面，Six1／Six4反式激活Fog2，F(xiàn)OG2可與GATA4共同上調Sry 表達，故與雄性性腺分化有關［31-32］。

7.MAP3 K1、MAP3 K4：近年促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在人類和小鼠性別決定中的作用逐漸引起重視。一些病例中MAP3 K1的突變改變其下游靶分子的磷酸化水平，最終使46，XY 患者表現(xiàn)為部分或全部性腺發(fā)育不全。同族基因MAP3 K4也被發(fā)現(xiàn)與性別決定相關。研究發(fā)現(xiàn)，在Map3k4的編碼區(qū)可發(fā)生byg 突變（一種無義突變），使酪氨酸受體激酶結構域發(fā)生區(qū)域截斷。在byg突變純合子小鼠體內，Sry 表達明顯下降，睪丸特有的細胞活動，如體腔上皮細胞增殖、中腎細胞遷移等均受到損害，相反，卵巢促進基因的表達卻被上調，最終導致XY 小鼠的性反轉［33］。

8.Gadd45g：生長抑制和DNA 損傷誘導45G蛋白（Gadd45G）是所屬蛋白家族中唯一能調節(jié)SRY 水平的蛋白質。Gadd45g 在雌雄兩性的早期性腺中表達水平相似，但在11.5dpc這一性別分化的關鍵時間在XY 性腺中表達水平達到頂峰。在不同基因背景中，Gadd45g 缺陷的XY 小鼠表現(xiàn)出從不育至雌雄間性表型等不同程度的DSD 或發(fā)生完全性反轉［34］。該現(xiàn)象的分子機制是Sry表達的級聯(lián)反應——MAP3K4和GADD45G 在MAPK 通路中起到轉換信號的作用，使GATA4磷酸化而激活，活化的GATA4 與Sry 的啟動子結合并激活其轉錄，從而啟動男性性別決定過程。當Gadd45g 基因缺陷時，這一通路被抑制，最終使Sry 表達被破壞，導致卵巢和Müller管發(fā)育［35］。

雖然至今未有人類Gadd45g-／-個體的報道，但Gadd45g-／-小鼠表現(xiàn)出的完全性反轉以及Gadd45g 是Sry 上游激活因子的事實都提示Gadd45g 可能是人類無綜合癥候的男性不育和46，XY 個體部分或全部性反轉的致病基因。

三、卵巢發(fā)育相關基因

1.WNT4：Wnt4于E9.5在兩性胚胎中表達，E11.5時，Wnt4在男性性腺中表達下調，在女性性腺及Müller管周圍間質中的表達仍維持。可知在原始性腺階段，Wnt4與雌雄胚胎Müller管形成有關［36］。Wnt4-／-XX 小鼠表現(xiàn)出 部分性 反轉，這些突變小鼠的性腺形態(tài)類似睪丸，但不形成睪丸索或表達睪丸支持細胞特有標記；Müller管消失而Wolff管繼續(xù)發(fā)育。攜帶WNT4突變的患者癥狀與突變小鼠表型類似［37］。說明該基因可抑制男性特有的脈管系統(tǒng)在卵巢內形成，可能是通過抑制Sox9 表達上調實現(xiàn)的。但功能獲得性實驗發(fā)現(xiàn)，異位表達Wnt4的雄性小鼠仍可形成雄性體腔脈管（形態(tài)和分支存在畸形），表明WNT4并非卵巢內唯一抑制男性脈管系統(tǒng)形成的因子或睪丸可表達某種對抗WNT4抑制作用的因子［38］。

2.RSPO1：Rspo1敲除的XX 小鼠形成雄性化性腺，但不表現(xiàn)為完全的性反轉，這與Wnt4無效表達的XX 小鼠的表型相似，提示二者作用于同一信號通路（激活β-連環(huán)蛋白）［39］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在Rspo1-／-的XX 小鼠性腺內，Wnt4的表達水平降低，經典Wnt信號通路無法激活，表明RSPO1是Wnt4上游的正調節(jié)因子，其編碼的分泌因子可維持β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定［40］。

目前已在多例46，XX 睪丸性患者體內檢測到RSPO1突變，表明RSPO1也是人類卵巢發(fā)育中的關鍵基因。RSPO1和WNT4都可促進卵巢發(fā)育而抑制睪丸發(fā)育，在46，XY 性腺發(fā)育不良患者體內檢測到染色體1p上含有RSPO1和WNT4的片段重復可支持這一事實。

3.FOXL2：對Foxl2 基因敲除、Wnt4 基因敲除、Foxl2和Wnt4 基因雙敲除三種小鼠的研究顯示，F(xiàn)oxl2和Wnt4基因雙敲除的XX 小鼠表現(xiàn)出睪丸分化和男性生殖細胞發(fā)育，說明Foxl2基因對顆粒細胞的形成必不可少［41］。此外，對成年XX 小鼠進行Foxl2基因條件敲除，發(fā)現(xiàn)其卵巢轉分化為睪丸，卵巢結構、導管形態(tài)及體細胞均表現(xiàn)出男性化特征，分子水平上Sox9 等睪丸分化相關基因的表達上調［42］。該結果表明即使在成年時期，F(xiàn)oxl2仍對卵巢形態(tài)和功能的維持起到重要作用。在人類，F(xiàn)OXL2突變通常與BPES綜合征有關，患者常伴有卵巢機能障礙（如卵巢早衰等）［43］。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxl2 敲除的小鼠體內Sf1表達水平遠高于正常小鼠，且該表達水平的改變與上游調控分子WT1、LHX9無關；進一步的實驗證明，F(xiàn)OXL2 通過直接與Sf1 啟動子的特定位點FLB1結合而抑制Sf1的表達［44］。

哺乳動物的性別決定是眾多基因參與的復雜程序，某一基因的功能喪失或表達失控，都將對其他基因產生重大影響，導致兩性發(fā)育異常。雖然目前對性別調控機制有了一定程度的認識，但這種認識并不系統(tǒng)完整。隨著生命科學的不斷發(fā)展，哺乳動物的性別決定機制這個謎團將逐步被解開，這將為多種人類性發(fā)育疾病的治療帶來光明。

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