宮頸癌相關microRNAs表達調控機制的研究進展

趙皓琦，賀斌，王介東，劉書言，徐祥波＊

（1.國家人口計生委科學技術研究所生殖生理室，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3 廣西醫科大學，南寧 530021）

宮頸癌是原發于子宮頸的惡性腫瘤，因其高致死率已成為世界范圍內危害女性健康的三大婦科腫瘤之一［1-2］。近60年以來，由于陰道細胞學檢查的廣泛應用，大大提高了宮頸癌的診斷水平，其發病率在發達國家有所下降。然而，宮頸癌年輕化的趨勢日益明顯，且中晚期宮頸癌的致死率仍高居不下。因此，對宮頸癌發生發展的機制研究特別是宮頸癌的年輕化發病機制仍有待深入。

microRNAs（miRNAs）是一類內源性非編碼蛋白的、長度約為18～25個核苷酸的小RNA。它們來源于具有發夾樣結構的轉錄體，通過與靶mRNA結合，啟動其降解和／或翻譯抑制，進而參與調控細胞的增殖、分化和凋亡［3-4］。腫瘤的發生發展是一個多因素、多階段的發展過程，腫瘤中的miRNAs具有抑癌型和致癌型兩種類型。在特定的腫瘤類型中究竟是哪一種miRNAs發揮功效，取決于特定的基因或通路［5］。miRNAs的異常表達對宮頸癌的發生發展、轉移、臨床分型、耐藥性以及預后不良具有重要的影響，然而miRNAs在腫瘤中異常表達調控機制的研究相對較少，而對其上游調節機制的認識是理解miRNAs在腫瘤中異常表達的根本所在，將有助于理解腫瘤發生發展機制以及為治療提供策略。因此，本文將對宮頸癌中miRNAs上游調控機制的現狀進行闡述。

一、miRNAs簡介

miRNAs主要定位在人類1號、14號、17號、19號和X 染色體上，在染色體中集中分布于3’非轉錄區（3’UTR）、基因間區域、內含子、外顯子以及非蛋白編碼區［6］。而在宮頸癌中，大多數的miRNAs位于內含子區域，極少數分布在3’UTR［7］，是由RNA聚合酶II產生的具有莖環結構及5’帽子和poly（A）尾 巴 的pri-miRNA 轉 錄 而 來［8］。在pri-miRNAs的轉錄過程中，會被細胞核RNA 聚合酶III Drosha裂解為miRNAs前體（pre-miRNAs），隨后pre-miRNAs經另一種RNA 聚合酶III Dicer的加工處理，最終形成成熟的miRNAs［2］。miRNAs可以通過堿基互補配對原則，與mRNA 的3’UTR 互補位點靶向結合，從而起到負向調控基因表達的功能。miRNAs與mRNA 的特異性結合能夠引起轉錄抑制和外切體mRNA 降解。實驗證據顯示，單個miRNA 平均可以抑制上百個mRNAs［9］。作為參與轉錄后調節的重要因子，miRNAs在真核生物各種生命活動過程中發揮著重要作用。

二、miRNAs的表觀遺傳修飾

異常的表觀遺傳改變是腫瘤細胞中比較常見的現象，如基因組DNA 的甲基化修飾異常、組蛋白修飾的改變和基因組印記等。研究表明，相當數量的miRNAs受到表觀遺傳的調控。一些miRNAs的表觀遺傳改變是引起宮頸癌癌變的重要因素。其中，表觀遺傳修飾對miRNA 表達的調節作用被認為是宮頸癌中miRNA 調節失控的主要原因之一，主要包括甲基化和組蛋白修飾［9］。

1.甲基化修飾與miRNAs：近年的研究顯示，miRNA 啟動子區域的甲基化修飾與宮頸癌之間存在著緊密的聯系，其異常甲基化修飾也是腫瘤表觀遺傳學的研究熱點。主要表現為抑癌型miRNAs的表達水平與其啟動子區域甲基化水平呈現負相關性，而致癌型miRNAs啟動子區域的低甲基化狀態與腫瘤的進展相關［10］。

宮頸癌發生和發展是一個非常復雜的病變過程，一般是由宮頸上皮不典型性增生到原位癌再到宮頸浸潤癌的發展構成的。根據宮頸上皮不典型性增生程度和范圍的不同，上皮內瘤變又分為CIN 1、CIN 2 和CIN 3。CIN1 極 少 轉 變 為 癌，CIN2 和CIN3有癌變的可能，由CIN1到CIN3病變等級逐漸加深。甲基化的miR-203和miR-375在CIN3組織和宮頸鱗狀細胞癌組織中表達顯著高于CIN1和癌旁組織組織［11］。而在宮頸癌細胞系中，臨近miR-203和miR-375啟動子區域的CpG 島表現出明顯的超甲基化。如利用去甲基化因子處理細胞系后，這兩種miRNAs的表達又趨于增加，表明甲基化修飾可以改變抑癌型miRNAs抑制腫瘤的作用。同樣，宮頸癌中抑癌型miRNAs（miR-124a、miR-34b和miR-203）表現為高甲基化狀態［12］，它們的高甲基化程度與宮頸癌的高風險性密切相關。這些結果提示由甲基化異常引起的miRNAs表達改變與宮頸癌的發生發展有著緊密的關聯。

2.組蛋白修飾與miRNAs：翻譯后修飾在蛋白質加工、成熟的過程中發揮著重要的作用，它可以改變蛋白質的物理、化學性質，影響蛋白質的空間構象及活性位點的暴露，進而影響蛋白質的生物活性。組蛋白的乙?；?、磷酸化、糖基化等共價修飾則可以使染色質的活性發生變化，從而起到調控基因轉錄的作用。

當前與調節miRNAs的表達相關的組蛋白修飾主要集中于組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?，對其它的翻譯修后飾研究相對較少。乙?；慕M蛋白可以使DNA 與組蛋白解離，核小體結構松弛，是調控基因活性的一個關鍵步驟。在宮頸癌、卵巢癌及乳腺癌中已有研究表明，抑制型組蛋白會導致抑癌型miRNAs 的基因沉默，其共價修飾標記物H3K9me3和H3K27me3 的高表達伴隨著抑癌型miRNA miR125b1基因的沉默［13］。對宮頸癌細胞系的研究［14］表明，當細胞經組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑處理后，pri-miR-214表達下調，而成熟型miR-214則表達上調。此外，HDAC 的處理后，miR-214 的 靶 基 因Bcl212、MEK3、JNK1 和Plexin-B1的表達顯著降低。除宮頸癌外，其它腫瘤中也廣泛存在組蛋白修飾調控miRNAs表達的現象。MHC-I 類鏈相關蛋白A（MHC classⅠchain-related A，MICA）是一種在腫瘤免疫監視中起非常重要作用的蛋白。肝細胞癌中組蛋白去乙酰酶抑制劑（HDIs）通過調控miR-17-92基因簇和微小染色體維持蛋白7（MCM7）可以上調MICA 的表達，從而增加由自然殺傷細胞所介導的肝細胞癌溶解的敏感性［15］。同樣在miR-17-92基因簇的研究中，三種HDIs均可降低該miRNAs基因簇的表達，并伴隨著基因簇靶基因表達的升高，miR-17-92的低表達可能部分緣于HDIs的抗增殖效應［16］。慢性淋巴細胞白血病中，HDAC 呈現出高表達趨勢，同時該酶能夠介導抑癌型miR-15a，miR-16和miR-29b的沉默，而當HDAC 被抑制后，這些miRNAs的表達又得到了恢復［17］。組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA 則能夠上調miR-200b，同時可以降低miR-146b的表達［18］，而這兩種miRNAs的靶基因所編碼的蛋白在蛋白酶體構成及泛素化降解中扮演著重要的角色。由此可見，在宮頸癌及其它癌癥中，組蛋白修飾，特別是由組蛋白去乙?；讣捌湟阴；敢种苿┧閷У男揎椬饔檬浅谆揎椧酝?，通過表觀遺傳修飾調控miRNAs表達的又一關鍵機制。

三、人乳頭瘤病毒（HPV）與miRNAs

HPV 與宮頸癌的發生發展密不可分。該病毒可以通過靶向失活宿主的抑癌基因影響細胞進程，使細胞凋亡、細胞周期調控、遷移以及免疫逃逸等腫瘤發生發展的重要關鍵過程失控。

現有大量證據表明，HPV 病毒所合成的蛋白與miRNAs之間有著緊密的聯系。miRNA 表達譜分析是miRNA 研究中的重要一環，利用miRNA 芯片聯合小RNA 測序技術可以高通量地進行表達譜篩選。利用該技術對包皮和陰道角化細胞中HPV16和HPV18 與miRNAs的分析顯示，miR-16、miR-25、miR-92a和miR-378顯著上調，而miR-22、miR-27a、miR-29a和miR-100 則顯著下調。這些miRNAs表達水平上的差異可能是由病毒蛋白E6、E7單獨或同時調控所導致［19-20］。在轉染有HPV16E5的人類角化細胞中，E5的高表達能夠下調miR-203和miR-324-5，同時上調miR-146a［21］。Au 等［22］研究發現，miR-23b在HPV 相關的宮頸癌中通常表現為低表達，它的靶標——尿激酶型纖溶酶激活因子（uPA）卻可在宮頸癌而非正常宮頸組織中被檢測到。HPV16E6 癌蛋白可以降低miR-23b 的表達并上調uPA，進而誘導宮頸癌細胞的遷移能力。

HPV 除了對miRNAs表達的直接調控作用外，還可能參與甲基化修飾。HPV 的類型與甲基化修飾密切相關。CaSki、HeLa、SiHa和C33A 是宮頸癌研究中常用的細胞系。miR-432、miR-1286、miR-641、miR-1290、miR-1287和miR-95的超甲基化現象存在于多種宮頸癌細胞系中。將這些細胞經去甲基化藥物處理后，miRNAs的高表達存在于CaSki、HeLa、SiHa這三種與HPV 感染有關的細胞系中，而未被HPV 感染的細胞系C33A 則無此情況［10］；Wilting 等［11］發 現miR-149、miR-203、miR-375和miR-638的啟動子區域明顯的高甲基化與HPV16和HPV18關系密切。

四、miRNAs海綿與miRNAs

在某些條件下，一些基因可能是miRNAs連接位點的真實靶標，但在其它條件下這些基因可能會作 為 miRNAs 的 假 基 因［9］，又 稱 海 綿 調 控 子（Sponge Modulators）或miRNAs海綿。miRNAs海綿由開放閱讀框（ORF）和含有miRNAs作用元件（MREs）的3，非翻譯區（3，UTR）組成，其中的MREs可以與多種miRNAs結合［23］。這種結合可以特異性地降低miRNAs的數量，從而抑制miRNAs發揮作用［24］。

在子宮內膜癌干細胞中，基因間長鏈非編碼RNA-RoR（linc-RoR）可以發揮miRNAs海綿的功效，抑制miR-145所引起的腫瘤干細胞球分化［25］。對于宮頸癌而言，miRNAs海綿同樣發揮著重要的作用。研究表明，八聚體結合轉錄因子4（Oct4）能夠上調miR-125b的表達，間接抑制宮頸癌細胞的凋亡和BAK1蛋白的表達，而miRNAs海綿能夠結合miR-125，使OCT4 對miR-125b 的作用得到抑制，抗凋亡能力受到破壞、BAK1 的表達得到恢復［26］。

在研究中，通過人工技術所合成的miRNAs海綿往往作為“誘餌”來有效地抑制miRNAs的功能，因而在腫瘤小分子RNA 的相關領域中得到了廣泛的應用。在膀胱癌的研究中，Yang等［27］發現高表達的miR-21伴隨著代謝相關基因的表達，利用慢病毒介導的miR-21 海綿通過敲低miR-21 的表達能夠降低糖酵解相關調控基因的表達，進而有效地抑制腫瘤細胞的糖酵解。人工合成的miRNAs海綿能夠用來敲降過表達的致癌型miRNAs，為腫瘤的靶向治療提供了又一行之有效的方法。此外，它也能夠用于阻斷抑癌型miRNAs，為解密miRNAs在癌癥發生過程中的作用提供新的途徑。

五、miRNAs多態性及其調控

miRNAs多態性與其調控關系密切。miRNAs分為前期miRNAs（pri-miRNAs）、前體miRNAs（pre-miRNAs）和成熟miRNAs三種。這些miRNAs及其與靶基因結合的位點上所呈現的單核苷酸多態性（SNP）可能參與調節miRNAs的結合親和性、改變靶基因的表達水平，進而增加癌癥的易感性［28-29］。近年來有研究表明，miRNAs相關的、位于miRNAs自身或連接位點上的單核苷酸多態性（SNPs），能夠顯著改變miRNAs 的產生和／或功能，進一步增加罹患癌癥的風險。

在對中國宮頸癌患者的研究中表明，pri-miR-218（rs11134527）的改變能夠調節miR-218的表達，這一多態性可能作為功能性的SNP，通過調節miRNAs的連接過程影響宮頸癌的發生［29］。Yue等［30］研究認為miR-146a（rs2910164）的多態性在中國人群中同樣與高風險性宮頸癌密切相關。另一項以亞洲患者為對象的研究［31］中發現，存在3 種miRNA多態即miR-146aG＞C（rs2910164）、miR-196a2C＞T（rs11614913）以及miR-499A＞G（rs3746444）。

其中，rs2910164 中C 等位基因與癌癥的低風險性相關。亞組分析顯示，中國患者中rs2910164C等位基因的降低與宮頸癌、肝細胞癌和前列腺癌關系密切。rs11614913多態性分析表明，TT 基因型與癌癥的低風險性有關，而rs3746444的G 等位基因則與之相反。Zhou 等［32］在宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）pre-miRs多態性的研究中發現，rs3746444和rs2910164的G 等位基因與高風險性的CSCC密切相關。Mi等［33］認為，miR-135b 結合位點上，當rs1131445中T 被C 取代后會損傷miR-135b與其作用靶點IL-16的結合，導致宮頸癌患病率的提高。在對宮頸癌中常見的三種SNPs（pri-miR-26a-1 rs7372209、pre-miR-27ars895819 和pri-miR-100 rs1834306）進 行 研 究 時 發 現，pre-miR-27a 中rs895819多態性呈現出顯著的宮頸癌相關性，其T等位基因、CT 或TT 基因型與宮頸癌的低風險性有關［34］。

綜上所述，隨著小RNA 新一代測序技術和miRNAs表達譜芯片等多種檢測方法的進步，現已在宮頸癌中篩選到多種差異表達的miRNAs，并對其中一些miRNAs的功能進行了驗證，證實miRNAs的異常表達與宮頸癌的發生發展密切相關。一個miRNA 可能有多個靶基因，而一個基因也可能受多個miRNAs的調控。相比較miRNAs對宮頸癌發生發展起重要調節作用的豐富研究成果，上游對miRNAs的調控機制的研究卻仍十分有限，因此探索導致miRNA 表達改變的原因十分重要，這不僅有助于理解宮頸癌的發生發展機理，更為尋找高特異性的早期診斷標志物、有效的藥物新靶標和宮頸癌個體化治療提供新的思路。

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