試紙法在食品安全快速檢測中的研究進展

程 楠，何 景，董 凱,3，羅云波，許文濤,,4,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心，北京 100083；3.北京福德安科技有限公司，北京 100083；4.食品質量與安全北京實驗室，北京 100083）

試紙法在食品安全快速檢測中的研究進展

程 楠1，何 景2，董 凱1,3，羅云波1，許文濤1,2,4,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心，北京 100083；3.北京福德安科技有限公司，北京 100083；4.食品質量與安全北京實驗室，北京 100083）

試紙法作為一種簡便、高效、低成本的檢測手段，其發展為食品安全快速檢測提供了有效的保障。本文從紙層析技術、化學比色技術、酶抑制技術、免疫分析技術、生物化學技術以及分子生物技術6個與試紙法結合的快速檢測技術出發，對試紙法的研究現狀進行梳理；以紙基微流控芯片、納米顆粒標志物和試紙分析儀為例分析了典型的試紙法創新途徑；最后對試紙法未來的發展趨勢進行展望。

試紙法；食品安全；快速檢測

近年來我國的重大食品安全事件屢見不鮮，要解決這些食品安全問題，就需要從農田到餐桌對食品的生產、加工、流通和銷售等各個環節進行全程監控和管理。而現有的食品安全監督管理體系普遍建立在儀器分析的基礎之上，不僅人力、物力消耗大，時間成本高，而且信息發布滯后，導致監管部門很難對問題食品進行快速反映[1]。因此，迫切需要大量能夠滿足現場、快速、準確、靈敏且成本低廉的食品安全分析檢測技術。試紙法，由于其制造和使用成本低、具有生物降解性和生物相容性、易涂層印跡、多孔纖維結構、憑借毛細管力無需其他外部動力、檢測背景通常為白色便于化學比色和熒光檢測等特點，已成為一個非常令人關注的檢測平臺[2]。隨著近幾十年試紙法的不斷發展，與不同類型檢測技術相結合的試紙可以對各種典型的食品污染物進行檢測。

試紙法是根據經過特殊制備的試紙與待測成分進行反應所顯示的顏色、熒光或磁性變化對待測成分進行目視定性或者儀器定量分析的一種快速檢測方法[2-3]。其制作方法比較簡單，通常是將配制好的反應液浸漬或涂劃在紙基上，并以適當的方式干燥而成試紙[4]。使用也很方便，只需將待測物質滴加在試紙上或者將試紙的反應區浸沒在待測溶液中即可完成檢測，使用者不需專門訓練就能掌握。試紙法作為一種快速的現場檢測方法，具有制作簡單、使用方便、價格低廉、靈敏性好、穩定性好、特異性強、反應迅速、無需設備、結果顯示直觀、一次性使用、不需檢修維護等特點[5]，在食品安全檢測領域顯示出良好的應用前景，并有望成為最廉價的分析檢測手段。

1 試紙法快速檢測技術的發展與現狀

目前，與試紙法相結合的檢測技術通常包括紙層析技術、化學比色技術、酶抑制技術、免疫分析技術、生物化學技術和分子生物學技術，常見的食品安全快速檢測試紙主要有紙色譜、化學比色試紙、酶抑制試紙、免疫層析試紙、微生物試紙和核酸層析試紙等。

1.1 紙層析技術

紙層析技術又稱紙色譜法，是試紙法最初的體現形式，早在20世紀40年代前后就出現了，直到1952年Martine和Synge因此項發明被授予“諾貝爾化學獎”后實現了紙色譜發展很大的突破[6]。在20世紀末21世紀初的20多年間，紙色譜在分析檢測領域已經有了非常廣泛的應用，從對有機物的檢驗發展到對無機物的檢驗，從定性檢驗發展到定量檢驗[7]。

紙色譜是用濾紙作為反應載體，將待測溶液用點樣器或者毛細管滴加在紙上并視為固定相，在紙層析的作用下作為展開劑的有機溶劑進行移動，同時待測溶液也會隨著展開劑的移動而移動，并且在水和有機溶劑兩相之間待測溶液中的各組分進行溶解分配，各組分經過展開后在紙上形成互相分離的斑點。定性檢測是通過把各組分的移動距離（Rf值）與已知樣的移動距離進行比較；而定量檢測則是將組分點取下來并用溶劑溶出，采用比色法或分光光度法來進一步完成定量[7]。例如，紙色譜目前可用于快速檢測食品中的機磷農藥[8]、金屬離子[9]、氨基酸[10]、蘇丹紅[11]等物質。

1.2 化學比色技術

化學比色技術是指食品中待測物質與試紙上特定的化學試劑發生特異性的化學顯色反應，繼而將顯色結果與標準比色卡進行顏色比對，從而實現定性或者半定量檢測[5]。化學比色試紙的優點是制作成本低廉、生產周期較短、操作相對簡便、顯色反應迅速和結果顯示直觀等。不足之處是化學比色技術的靈敏度不高，很難對待檢物質進行痕量檢測；此外，此類方法非常依賴待測物質自身的化學反應條件，因此容易在檢測過程中受到外部環境的干擾[4]。目前，化學比色試紙是應用最為廣泛、技術最為成熟的快速檢測方法，被普遍應用于食品中非法添加物質和農產品中化學有害物質的現場檢測，如用化學比色試紙快速檢測食品中的過氧化氫[12]、亞硝酸鹽[13]、尿素[14]、工業堿[15]、二氧化硫[16]等物質。

1.3 酶抑制技術

酶抑制技術是以待測物質對酶的抑制作用為基礎的一種快速檢測方法，主要適用于重金屬檢測和農藥殘留檢測，通常使用脲酶進行重金屬檢測[17]，使用植物酯酶、動物酯酶或膽堿酯酶進行農藥殘留檢測[18]。其測定原理是作為底物的待測物質與相應酶的活性中心進行結合，從而使酶的性質和結構發生改變導致其活性降低，繼而通過可識別的變化來實現對待測物質的檢測，最常見的是通過顏色的變化進行判斷。酶抑制試紙通常是將酶和作為底物的待檢物質分別固定在兩片試紙上，然后使兩片試紙相互接觸，待測物質對酶的抑制作用會發生催化反應同時出現顏色的變化，據此對待測物質進行目視定性或定量的檢測。這種方法具有操作簡單、成本低廉等突出優勢，適用于監管部門在農貿市場和超市等食品集散地進行現場快速檢測。但由于在靈敏度和保存期等方面存在一定的局限性，假陽性和假陰性率較高，尤其在檢測生姜、蔥、蒜等農產品時容易受到干擾，因此只能在食品安全檢測中作為初步篩選的依據。目前，歐美國家已將其作為田間實地檢測和農藥殘留情況普查的基本手段，但是在我國應用的并不廣泛[5]。

1.4 免疫分析技術

免疫分析技術是以醫學中的血清學檢測手段為基礎，利用抗原與抗體之間反應的高度專一性來完成檢測[19]。免疫層析試紙有夾心法、競爭法和間接法3 種，以夾心法為例，其原理是將待測物質的特異性抗體交聯到有色物質（如納米金）上以及試紙條（檢測線）上，當“有色物質——抗體”和抗原結合后，該復合物再與紙上包被的抗體相結合，形成類似于三明治的夾心結構。通過觀察檢測線和控制線顏色的變化實現目視定性檢測，根據檢測線顏色的深淺與待測物的含量呈正比的原則進行定量的檢測，如果沒有待測物則只有控制線有顏色[20]。

免疫分析技術廣泛用于檢測農獸藥殘留[21-22]、微生物[23]及轉基因食品[24]，這種技術靈敏度和特異性都比較高，適合于監管部門在現場進行初篩檢測；其不足之處在于這種方法的廣譜性很難實現，因為抗原和抗體之間反應專一性較強，這就需要針對不同的待測物質建立專門的檢測試劑和條件；并且檢測結果的準確程度還要取決于在加工過程中食品中的抗原成分是否遭到破壞。目前，國外利用免疫分析技術研發的試紙條已經商業化，如美國Charm Science公司研發的ROSA系列免疫層析膠體金試紙條，可以用于檢測牛奶中各種抗生素殘留[25]。

1.5 生物化學技術

生物化學技術與試紙法的結合主要應用于食源性致病菌等微生物的檢測。這種微生物試紙法通常由雙層薄膜組成，一層是印有網格的聚丙烯薄膜，另一層是覆蓋有培養基和顯色物質的聚乙烯薄膜。待測樣品經過處理后不需要增菌可直接接種在微生物試紙上，在適宜的溫度下進行培養，待檢微生物生長產生的特異性酶和已固定的顯色物質之間發生反應，就形成了不同顏色的菌落，通過對待測微生物的菌落進行計數即可實現快速檢測[26]。

這種生物化學技術檢測微生物最大的優點是省卻了繁重的準備和收尾工作，縮短了檢測時間，有助于提高微生物檢測效率。另外，其檢測原理是活細胞技術，符合國內有關食品安全和衛生質量控制標準法規的要求，使檢測結果更易于被大眾所接收[27]。不足之處是目前的顯色系統比較單一而無法針對所有微生物進行有區別地計數；以及培養基或顯色物質在試紙尚分布不均勻而導致微生物生長分布或顯色不均勻。目前，國內雖有微生物試紙的生產廠家，但是產品質量參差不齊，檢測結果不能得到普遍認同。較成熟的微生物檢測試紙主要依靠進口，如美國3M公司研發的PerrifilmTMPlate系列微生物測試片，可分別準確檢測菌落總數、大腸菌群計數、霉菌和酵母計數[28]。

1.6 分子生物學技術

分子生物學技術與試紙法的結合使待檢物質達到了基因分子水平。近年來，核酸層析試紙和基因芯片成為了國內外研究的熱點。核酸層析試紙是將分子生物學中的核酸擴增技術和層析試紙方法結合在一起的一種技術，從而既有核酸擴增的高靈敏度，又有層析試紙操作簡便、價格低廉的優點[29]。基因芯片是隨著基因技術和材料科學不斷發展而衍生出的一種可以迅速檢測基因序列及表達信息的一種技術。該技術原理是通過已知序列與未知序列進行雜交，并對每一雜交信號進行處理分析，從而得出未知序列信息[30]。使用核酸分子水平的試紙進行檢測，其優點在于檢出限量低、檢測周期短、檢測效率高、能夠實現多重檢測，并且解決了檢測深加工產品的難題。不足之處在于檢測費用仍偏高，且前期需要大量已測序的DNA片段信息。分子生物學技術與試紙法的結合具有很大的發展前景和應用價值，目前已經應用于檢測食品中致病菌[31]、病毒[29]、MicroRNA[32]和轉基因成分[33]等。

2 試紙法創新研究

近年來，試紙法研究的創新點主要集中在載體材料的改良、標志物的選擇和對待測物進行定量檢測等方面。

2.1 載體創新：紙基微流控芯片

自從20世紀90年代瑞士科學家Manz提出微型全分析系統的概念[34]以來，微流控芯片作為其中的核心技術己經逐漸發展為世界上最先進的科學技術之一。紙質微流控芯片是由Martinez等[35]于2007年首次提出，并在近期得到迅速發展的新型微流控芯片。該微流控芯片以濾紙作為載體材料，制作技術有光刻技術、噴墨印刷技術、蠟印刷技術、打印PDMS和等離子體氧化等，制作的成品可以對待檢樣品進行高效的分析檢測。紙質微流控芯片具有成本低、制備簡單、無需復雜設備等優點，并更趨近微型化、集成化、多功能化，所以非常適合在資源匱乏的情況下使用[36]。

目前，紙基微流控芯片主要分為3 類：平面二維紙基微流控芯片[36]、二維紙基ELISA板[37]和三維紙基微流控芯片[38]。Martinez等[35]用憎水性的聚合物在親水性的紙上光刻分界限從而形成二維紙基微流控通道，提供了在同一平臺上同時檢測蛋白質和葡萄糖的分析方法，并且通過更改適當的檢測試劑，還可以進一步適用于其他物質的測定。繼而該研究小組研發了二維紙基ELISA板，它可以取代傳統的較為昂貴的ELISA板[37]，并且更容易儲存，與塑料孔板實驗方法兼容，實驗后可以將實驗結果直接歸檔保存。該研究小組還通過用雙面膠把多 個蠟染紙黏合在一起的方式，首次研發出了三維紙質微流控芯片[38]，該裝置有4 個互不干擾的獨立通道，可以在一個紙基芯片上同時分析多種化合物，對于有多重分析任務的現場快速檢測表現出很強的實用性和優越性。Liu Hong等[39]研發一個以三維折紙為基礎的微流控芯片，簡化了Martinez團隊制做過程中的多個步驟。Lewis等[40]用蠟染技術來制造高通量的三維紙基微流控芯片，1 h內可以制造出數以百計的紙基微流控芯片。可見，由于紙基微流控芯片具有生產成本低、成產周期短、檢測速率快、所需樣品的體積小、攜帶方便、可一次性使用、可進行多重檢測等優點，已經被越來越多地關注和研究，擁有很好的發展前景。

2.2 標識創新：納米顆粒標志物

納米顆粒又稱超微顆粒或納米塵埃，是指顆粒大小為納米級（一般在1～100 nm之間）的粒子，其性能不同于正常粒子，具有比表面積大，光、熱、磁敏感等特征，具有重要的科學研究價值和應用前景[41]。目前已經應用于試紙法的納米顆粒標志物包括有機納米粒子、膠體金、鑭系元素、量子點、納米磁性顆粒、碳納米管等幾大類。

有機納米粒子具有良好的光學特性，是早期應用于試紙法中的一類標志物，如異硫氰酸酯熒光素，其熒光分子中的異硫氰酸與蛋白分子中的氨基相結合，以結合物中的熒光素為檢測對象實現對標記蛋白的檢測[42]。但因為這種方法檢測靈敏度低、光化學穩定性差，過于依賴粒子本身的化學發光集團，不具備無機納米粒子可調控波長的尺寸效應，故應用上正逐漸被新的標志物所取代。

膠體金又稱金溶膠，是指金顆粒在水中依靠靜電斥力形成穩定的多相不均勻體系[43]，由于其電子密度高，在不影響生物分子活性的前提下可以吸附生物大分子，且呈現出橘紅色到紫紅色等不同的明亮色彩，故可作為標志物精確定位多種大分子物質，包括蛋白質、多糖、核酸、激素等。以膠體金作為標志物制作的試紙是研究最早也是目前研究最廣泛的，因此報道繁多，包括檢測黃曲霉毒素[44]、副溶血性弧菌[45]、蘇丹紅[46]、MicroRNA[47]等物質，甚至許多已經實現大規模商品化，如檢測各種獸藥殘留和農藥殘留金標試紙。

鑭系元素屬于過渡元素，是指元素周期表中原子序數在57～71之間的所有元素。將兩種不同的鑭系元素離子分別作為“光吸收子”和“發射子”，將其摻入到作為“主基質”的陶瓷顆粒之中，會構成一類可以產生熒光的上轉換磷光顆粒[48]。Hong Wenyan等[49]研制的以上轉換磷光顆粒為標志物的試紙其靈敏度和定性的結果可以和免疫學中的經典實驗——酶聯免疫吸附實驗相媲美。可見，將鑭系元素應用與試紙中具有較為理想的檢測限和穩定性，故其應用研究發展的十分迅速。

量子點又稱為熒光半導體納米顆粒，主要包括主族Ⅱ～Ⅳ（如CdSe），Ⅲ～Ⅴ（如InP）、副族化合物以及Si等元素組成的納米顆粒，顆粒直徑約1～10 nm，因其外觀形態好似一顆極小的點狀物而得名。目前通常用來作為標志物的是一種核殼結構的量子點，它不僅具有較好的光化學穩定性，而且也具備了較高的發光量子產率（30%～50%）[50]。目前，以量子點為標志物的試紙尚處于研究階段，在國內外有一定數量的相關報道，如Petryayeva等[51]可在5 min內對蛋白酶進行定量檢測，最低檢測線達1～2 nmol/L。

納米磁性顆粒又稱超順磁顆粒，兼具磁性粒子和納米材料的雙重優勢，包括超順磁性、比表面積大和粒徑小等特點，是近年來新興的一種納米材料。典型的標志物是以磁性材料（如四氧化三鐵等）作為固相載體，在其表面引入活性基團，通過偶聯反應與酶、抗體等生物分子結構結合，可對待測物質進行快速、定量的檢測[52]，但因為磁性顆粒在層析過程中易發生團聚等現象[53]，使納米磁性顆粒作為試紙標志物的報道尚不多見。

碳納米管又稱巴基管，是一種具有空間拓撲結構的量子材料，其結構可看成是彎曲的石墨六角形網格結構。它具有一般納米粒子的量子效應，且比表面積大、電導率高、機械強度高，其明顯的黑色更加有利于在定性或半定量檢測中被肉眼清晰辨識[54]。不過技術難點在于很難去除碳納米管中混雜的石墨碳、無定型碳碎片等雜質，相關的文獻也有限[55]，可見該項研究仍處于早期階段。

2.3 定量創新：試紙分析儀

研究初期，試紙法只能定性檢測，即只有“陰性/陽性”的結論。隨著研究的不斷發展，在標準比色卡引進后，試紙法既可以進行目視定性檢測，又可以進行半定量分析[56]。而在新型配套微型測量讀取儀相繼出現以后，試紙法定量結果的精確度得到大幅度提高，從而使試紙法發展為可根據需要直接進行定量檢測的分析方法[57]。這些配套的試紙分析儀既有較高的靈敏度，能夠滿足一般檢測要求又具有體積小、質量輕、便攜、快速、成本低、能夠獨立處理數據、對人員要求不高等優點，有著廣闊的市場前景和發展空間。

目前，國內外試紙分析儀分為針對光學信號、熒光信號和磁學信號3 種。其中，以光學信號的試紙分析儀居多，主要有3 種：利用光敏電阻測量試紙反射光光強獲取試紙反應信號；采用反射型光纖傳感器獲取反應信號；以及利用圖像傳感器采集試紙圖像并分析反應信號強度[58]。如德國默克公司生產的一種試紙分析儀，就是利用光敏電阻測量試紙反射光光強獲取試紙反應信號的一款儀器。該儀器的反射儀側面設計有一個可供插入試紙條的小門和一個可以讓光線通過的小窗口，當光線照射到試紙條上后，一部分被試紙條吸收，另一部分被反射到CDS光電池上，然后通過微安計來檢測電流量，繼而轉化為待測物質的濃度直接顯示在顯示器上，可以快速、直觀地完成定量檢測[56]。

隨著電子信息的快速發展，人們可以隨時隨地以多種方式進行信息訪問，其中智能手機是最常用的方法之一。許多研究[59-60]用智能手機、照相機或掃描儀記錄試紙的顯色區域，再用Adobe Photoshop分析顯色區域的顏色，快速完成數據采集、信號處理、數據分析和得出結論等步驟。這種方法是通過圖像傳感器獲取試紙圖像，以圖像測量原理為基礎運用軟件捕獲試紙的顏色特征，利用統計數據分析和判讀圖像并得出定量的檢測結果[58]。雖然圖像傳感器的分辨率對試紙圖像的分析精度有一些影響，但是這種方法因具有成本低廉、操作簡單、檢測快速、便于攜帶等優勢越來越受到人們的關注。

3 結 語

試紙法作為一種快速、靈敏的檢測手段，在食品安全現場檢測領域展示出了良好的應用前景。在過去的20年中，世界各地許多科研團隊為改善試紙的性能做出了很多的努力，如提高敏感性和特異性、加快響應時間、提高分析能力和降低成本等[61-62]。然而，國內研發和生產的試紙不僅種類十分有限，而且性能指標也遠遠達不到現場檢測的需要[56]，如穩定性差，保存條件十分苛刻；保存期短，且無法適用于極端環境；靈敏度低，不能實現痕量檢測的要求；特異性差，容易出現交叉反應等。因此，接下來對于試紙法的研究應該致力于對其優越的載體材料性能、多元的檢測內容和形式、新型的顯色劑和顯色體系、精準的定量方法和儀器等方面，努力擴大試紙的檢測范圍，提高試紙的檢測性能，為試紙法在食品安全快速檢測領域的進一步發展提供更廣闊的空間。另外，為了有效地將危害阻止在食品生產和流通環節，應該將試紙法推廣并應用到食品企業生產加工、監管部門監督檢查以及百姓的日常生活中，這樣不僅有利于改善民眾對食品安全現狀的認知，更有助于提高政府公信力、促進社會和諧發展。

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A Review on Research Progress of Test Strips for Rapid Food Safety Detection

CHENG Nan1, HE Jing2, DONG Kai1,3, LUO Yunbo1, XU Wentao1,2,4,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modifi ed Organisms Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China; 3. Fudean of Beijing Technology Co. Ltd., Beijing 100083, China; 4. Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing 100083, China)

As a simple, effi cient and low-cost detection approach, test strips provide an effective guarantee for the rapid detection of food safety. This article reviews the development of test strips based on paper chromatography, chemical colorimetry, enzyme inhibition, immunoassay, biochemistry and molecular biological technology. The applications of innovative approaches such as microfl uidic paper-based analytical devices, nano-material markers and paper analyzer in test strips are summarized. Finally, future prospects in this area are discussed.

test strip; food safety; rapid detection

TS201.6

A

1002-6630（2015）01-0256-06

10.7506/spkx1002-6630-201501049

2014-03-04

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2012AA101606）

程楠（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全快速檢測。E-mail：GoodLuckChengNan@163.com

*通信作者：許文濤（1979—），男，副教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：Xuwentao1111@sina.com