冷藏醬鴨中乳酸菌的分離鑒定及生物學特性研究

陳娟娟等

摘要： 從冷藏的醬鴨中分離篩選乳酸菌，對其進行生理生化特性研究和分子學鑒定。結果表明，從冷藏醬鴨中篩選到2株優良乳酸菌，分別命名為J1、J2。結合細菌形態學、生理生化特性和16S rDNA序列同源性以及系統進化樹分析表明J1、J2為副干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus paracasei subsp.），具有比較好的發酵產酸的能力，并且對大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）具有很強的抑制作用，能夠耐受極端的pH環境。

關鍵字：醬鴨；乳酸菌；分離；鑒定

中圖分類號：Q939.11+7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）03-0676-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.044

Identification and Biological Characteristics of Lactic Acid Bacteria Isolation

from the Sauce Duck in Low Temperature

CHEN Juan-juan1，ZHOU Yan-qing1，LI Jing-yun1，ZHANG Yu1，WANG Wan-shen1，FAN Yu-xia1，

CHANG Zhao1，YUE Xiao-jie1，YUAN Lu-lu2

（1.College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China；

2. Zhoukou Science and Technology Bureau，Zhoukou 466000，Henan， China）

Abstract： The research aimed to isolate and screen the fine lactic acid bacteria from the sauce duck in low temperature and identify them by molecule and biochemical test. Two strains of lactic acid bacteria were isolated and named J1 and J2. With the analysis of bacterial morphological， physiological and biochemical characteristics， 16S rRNA sequence homology and phylogenetic tree analysis， it showed that J1 and J2 were Lactobacillus paracasei subsp. J1 and J2 have a good ability to produce acid fermentation and to inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus， and both can tolerate extreme pH environment.

Key words： sauce duck； lactic acid bacteria； isolation； identification

乳酸菌是一種常見的益生菌，具有直接為宿主提供營養物質、促進人和動物生長、調節胃腸道及泌尿生殖道的正常菌群、增強機體免疫和維持微生態平衡等多種功能[1]，被廣泛應用到醫學、食品、飼料工業和環保等方面。乳酸菌在自然界分布廣泛，從人體及動物的腸道，到植物、發酵食物、飲料乃至土壤中都存在乳酸菌。曾經有研究者報道過從腸道內容物[2]，發酵的乳制品[3，4]，腌制的泡菜[5，6]，冷藏的鮮肉[7]，發酵的肉制品[8]中分離出各種優質乳酸菌。

肉類中，鴨是一種常見的加工原材料，可以直接或發酵后制成板鴨、鹵鴨、醬鴨、蝦油鴨等[9，10]，每一種做法都會賦予其特殊的風味。乳酸菌在發酵的過程中可以產生乙醛和雙乙酰等風味物質，從而使發酵制品具有特殊的風味，而發酵的鴨類可能是因為乳酸菌產生了一些風味物質，使其有了獨特的風味。林巧[9]從發酵的建昌板鴨中分離到了17株菌株，通過形態學和生理生化特征進行了鑒定，并從中篩選出了一株耐鹽的適合發酵板鴨的菌株。本研究旨在從冷藏的醬鴨中分離乳酸菌，通過形態學、生理生化特征和基因學進行鑒定，再通過發酵產酸試驗、低pH耐受試驗、抑菌試驗等進一步研究其特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 從河南省新鄉市溫州醬鴨店購買一只醬鴨，放于無菌的袋子里并放進冰盒內，帶回實驗室于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.1.2 培養基 MRS培養基，明膠液化培養基，葡萄糖產酸培養基，葡萄糖酸鹽產酸培養基，脫脂奶粉培養基，按文獻[11]的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離及篩選 將放在4 ℃冰箱2周的醬鴨取出，用無菌解剖剪取1 g，并且充分剪碎，加入9 mL無菌生理鹽水中，充分搖勻，然后依次稀釋到10-4、10-5、10-6，分別吸取100 μL接種在含1.5%的CaCO3的MRS平板培養基上，37 ℃恒溫培養箱內培養48 h。挑取具有透明圈的單菌落劃線純化，連續純化3次，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定 參照文獻[11]，通過革蘭氏染色、接觸酶反應、運動性試驗、明膠液化試驗、葡萄糖和葡萄糖酸鹽產酸產氣試驗、甘油發酵試驗、D-山梨醇發酵試驗、淀粉發酵試驗、蔗糖發酵試驗等對分離到的乳酸菌進行初步的鑒定[11]。

1.2.3 乳酸菌的分子鑒定 將活化好的菌株利用CTAB的方法提取菌株的總DNA，以基因組DNA為模版擴增16S rRNA。引物是用Chao等[12]報道過的引物，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1541R： AAGGAGGTGATCCAGCCGCA擴增其16S rRNA，引物由華大生物有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，其中10×EasyTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL， EasyTaq 0.25 μL，模版DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，無菌去離子水16.75 μL。反應條件：94 ℃ 3 min預變性；94 ℃ 30 s ，55 ℃30 s ，72 ℃ 1 min，進行35個循環；最后72 ℃ 延伸10 min；4 ℃保存。用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收1 500 bp左右的片段，用生工生物工程（上海）有限公司的膠回收試劑盒回收，回收產物送到生工生物工程（上海）有限公司進行測序，測序結果在NCBI GenBank數據庫中進行同源性比較，并且用MEGA5.05建系統進化樹做進一步的分析。

1.2.4 乳酸菌產酸能力的測定 乳酸菌發酵產酸的能力是作為發酵酸奶的優良菌株篩選的重要指標。酸奶的酸度一般以中和100 mL牛乳所需的0.1 mol/L氫氧化鈉的毫升數來表示，稱為°T，此為滴定酸度簡稱為酸度。將待測菌株接種于MRS培養液，37 ℃恒溫培養過夜，活化3代，以充分活化實驗菌株。將活化好的菌株按3%的接種量接種于裝有10%脫脂乳培養基的試管中，37 ℃恒溫培養至凝乳，記錄凝乳時間。凝乳后置于4 ℃冰箱中后熟24 h，測定每個管的pH和滴定酸度。每株3個重復。

pH的測定用PHS-320型酸度計測量，測酸度用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定，采用吉爾涅爾度（°T）表示，按參考文獻[13]。具體步驟：量取10 mL鮮乳，注入150 mL三角燒瓶內，用20 mL中性蒸餾水稀釋，加入1%酚酞指示劑5滴，小心混勻，用0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定，不斷搖動，直至微紅色在1 min不消失為止。將滴定時所耗的0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液的量乘以10，即為100 mL酸奶的酸度。

1.2.5 乳酸菌耐酸能力的測定[14] 將待測菌株接種于MRS培養基中培養48 h，8 000 r/min，4 ℃離心10 min。細胞沉淀用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液沖洗2次，并懸浮至細胞密度為1×1012個/mL。然后加到pH為1.0、2.0、3.0的磷酸鹽緩沖液中32 ℃孵育，每1、2、3、4 h取出100 μL接種在MRS平板培養基上，同時取100 μL沒有經過低pH磷酸鹽緩沖液處理的菌液接種在MRS平板培養基上，34 ℃培養48 h，最后記錄平板上的單菌落個數。乳酸菌的存活率的計算方法是用低pH處理過的單菌落數除以沒有經過處理的單菌落數。

1.2.6 乳酸菌的抑菌能力測定[14] 將待測菌株接種在MRS液體培養基中活化3代后，取100 μL接種在MRS液體培養基中37 ℃過夜培養，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清培養液，調節pH為5.5（pH 5.5時抑菌能力最大），用來檢測抑菌活性。指示菌株有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。在雙層平板上用無菌打孔器打出直徑為6 mm的孔，將100 μL無菌的培養液加入孔內，以不溢出為宜，于4 ℃過夜使加入的培養液充分擴散，37 ℃培養48 h。抑菌能力通過測量抑菌圈的直徑來表示，單位為mm。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選結果

從冷藏醬鴨中分離得到表面光滑濕潤、邊緣整齊、乳白色的菌株共25株，分別命名為J1、J2、J3、J4…J24、J25。其中J1、J2的透明圈最大，透明圈越大說明其產酸能力越強，發酵能力就越強。故對J1、J2進行了鑒定及性能研究。

2.2 菌株的鑒定結果

2.2.1 菌落及菌體形態特征鑒定 J1、J2的菌落及菌體特征見表1。從表1中的菌落形態以及菌體形態可以鑒定這2株菌株為桿菌，并且可以初步鑒定為疑似乳酸菌。

2.2.2 生理生化鑒定 生理生化鑒定結果如表2，結合菌落和菌體形態，可以初步判斷這2株菌株是乳酸桿菌。J1、J2均可發酵葡萄糖產酸而不產氣，發酵葡萄糖酸鹽產酸產氣，因此可以判J1、J2為兼性異型發酵的乳酸桿菌。

2.2.3 16S rRNA PCR擴增產物和測序結果 將J1、J2用液體培養基活化3次后提取細菌基因組DNA，進行16S rRNA PCR擴增、回收、測序，獲得長度分別為1 512 bp和1 516 bp的堿基序列，將這兩個序列在NCBI GenBank數據庫中進行同源性比對發現J1、J2與干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌亞種、干酪乳桿菌亞種、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的同源性都達到了99%。按照目前通用的分類標準：具有99%～100%序列相似性的判定為1個種，具有97%～99%序列相似性的判定為1個屬，可將J1、J2判定為乳桿菌屬。下載干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌亞種、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的16S rRNA的序列，用MEGA5.05建系統進化樹如圖1，從圖1中可知，J1、J2與副干酪乳桿菌亞種（L. paracasei subsp R094， L. paracasei subsp. NBRC 15906）在一個分支上，結合NCBI GenBank數據庫中Blast比對結果，可以將J1、J2鑒定為副干酪乳桿菌亞種。

2.3 乳酸菌的性能測定結果

2.3.1 乳酸菌的產酸能力 乳酸菌發酵脫脂奶粉產酸的能力是發酵酸奶優質菌株的重要指標。J1、J2乳酸菌的發酵脫脂奶粉產酸結果如表3，從表3可知，這兩株菌株發酵酸奶時酸度都比較低，說明其發酵產酸的能力比較強，可能是潛在的優良菌株。

2.3.2 乳酸菌的耐酸能力 人體胃的pH介于1.5～20，因此能夠耐受極端的pH是益生菌的另一個重要特征。圖2簡單地說明了J1、J2在pH 1.0、2.0、3.0的條件下1、2、3、4 h存活率。經過研究發現J1、J2在pH 3.0的條件下，1 h之后的存活率分別為70%、76%，4 h之后仍然有存活的菌株，并且在pH 1.0和2.0的條件下，4 h后也仍然有存活菌株，說明J1、J2具有一定的耐酸的能力。

2.3.3 乳酸菌的抑菌能力 經過抑菌試驗發現J1、J2這兩株菌株對大腸桿菌（E. coli）和金黃色葡萄（Staphylococcus aureus）具有很強的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到了15 mm以上，對大腸桿菌的抑菌圈直徑甚至達到了30 mm以上（表4）。

3 小結與討論

該研究從冷藏醬鴨中分離篩選到的2株菌株經過形態學、生理生化、16S rRNA序列鑒定為副干酪乳桿菌亞種，分別命名為J1、J2。通過對其性能的研究發現J1、J2具有很強的發酵產酸和抑菌的能力，并且具備一定的極端pH環境的耐受能力。另外，陳艷梅[15]從酸奶中分離到的乳酸菌發酵脫脂奶粉產酸的最低的pH是4.35，而J1、J2達到了4.30、4.36，說明J1、J2發酵產酸的能力與用于酸奶發酵菌株的發酵能力不差上下。同時，從抑菌試驗結果中可以看出，J1、J2具有一定的抑菌能力，尤其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有很強的抑制作用，對金黃色葡萄球菌抑菌圈的直徑達到了15 mm以上，對大腸桿菌的抑菌圈直徑甚至達到了30 mm以上。Iyer等[14]報道過從米糕中分離到的2株抑菌能力強的菌株對大腸桿菌的抑菌圈的直徑達到了9 mm以上，與之相比，J1、J2具有更強的抑菌能力。霍小琰等[16]從酸馬奶中分離到了10株乳酸菌，并做了大腸桿菌的抑菌試驗，其中抑菌圈直徑最大是16.30 mm，進一步表明乳酸菌J1、J2的抑菌能力強。J1、J2還具有一定的耐受低pH的能力，可以在pH為1、2、3的條件下4 h之后仍能夠存活，說明其能耐受低pH。總的來說，J1、J2具有發酵能力強、抑菌能力強、耐酸等特性，是兩株優良的乳酸菌。

本研究從冷藏醬鴨中分離篩選到了2株副干酪乳桿菌亞種，其具有很強的發酵產酸、抑菌以及耐酸等能力，是優良的益生菌菌株，可用于發酵制品的研究。另外因J1、J2具有很強的抑菌能力，具有保藏醬鴨以及其他儲藏食品的潛力。

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