環氧化酶－2－765單核苷酸多態性與寧夏人群慢性胃炎中醫證型相關性研究※

馬曉勇 馬玉寶 楚國慶 丁玉梅 李建紅 金建寧

(寧夏醫科大學總醫院中醫科，寧夏 銀川 750004)

慢性胃炎是消化系統常見病，在我國人群中發病率高，其發病除了受外界環境因素刺激外，還與個體基因遺傳差異有關。目前，國內外很多研究已證實環氧化酶－2(COX－2)基因多態性與慢性胃炎發病有關，但關于COX－2基因多態性與慢性胃炎中醫辨證分型研究卻不多見。隨著分子生物學技術和生物信息學發展，對慢性胃炎易感基因研究已成為該病發病機制研究熱點之一。目前，慢性胃炎中醫發病研究多采用辨病與辨證相結合模式，但若在病證結合基礎上探討慢性胃炎中醫辨證分型與基因多態性的相關性，將有利于中醫辨證分型客觀化和規范化，有利于進一步提高慢性胃炎中醫辨證分型論治水平和臨床療效。我們應用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性(PCR－RFLP)方法檢測400例慢性胃炎中醫辨證分型患者COX－2－765G/C位點單核苷酸多態性(SNP)，并進行基因分型，旨在探討慢性胃炎中醫證型與COX－2基因多態性的相關性，為慢性胃炎診治提供中西醫結合理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組400例均為寧夏醫科大學總醫院中醫科2009－01—2013－10住院(226例)及門診(174例)患者，近3年居住生活在寧夏，男243例，女157例;年齡12～20歲5例，20～60歲295例，60～86歲100例。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標準 西醫診斷標準參照中華醫學會消化病學分會制訂的“中國慢性胃炎共識意見”［1］。中醫診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》(試行)［2］可將慢性胃炎分為肝胃不和、脾胃虛弱、脾胃濕熱、胃陰不足、胃絡瘀血5種證型。

1.2.2 納入標準 符合慢性胃炎西醫診斷標準;符合慢性胃炎中醫診斷標準;年齡18～85歲之間，性別不限。

1.2.3 排除標準 慢性萎縮性胃炎伴重度異型增生、上消化道出血、消化道潰瘍、胃腸道腫瘤者;消化系統器質性病變(如慢性胰腺炎、肝硬化等)，或有影響消化道動力的全身疾病(如甲狀腺功能亢進癥、糖尿病、慢性腎功能不全、精神和神經系統病變等);伴有心、肝、腎等主要臟器嚴重病變、造血系統疾病以及腫瘤等患者;孕婦及哺乳期婦女;有神經系統及精神疾病史。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 一般記錄項目 收集所有患者臨床信息，包括年齡、性別、民族、癥狀、個人史、職業史、既往疾病史、家族史、吸煙史、飲食習慣、胃鏡檢查、Hp感染史及中醫辨證分型等。

1.3.2 觀察項目 對所有患者行中醫辨證分型并檢測COX－2基因表型分布和等位基因頻率。

1.3.3 標本收集 抽取患者外周血作為檢測樣本，所有研究對象均于上午空腹抽取靜脈血標本5 mL，然后注入含肝素抗凝劑的真空管中混勻，－80℃冰柜保存備用。

1.3.4 基因檢測 運用PCR－RFLP技術檢測COX－2－765G/C位點SNP并進行基因分型。基因檢測與分型由寧夏醫科大學分子醫學實驗室專人負責完成。基因多態性分析的主要步驟包括:①全部患者均取外周靜脈血5 mL，采用基因組脫氧核糖核酸(DNA)快速提純試劑盒(DNA Extractor WB－ Rapid Kit，WaKo code No 293－54803 200exp，日本WaKo pure化學有限公司)抽提基因組DNA，溶于TE(Tris+EDTA)緩沖液，－20℃保存備用。②COX－2－765G/C基因片段的擴增;③限制性內切酶消化擴增片段COX－2－765G/C;④凝膠電泳;⑤基因分型。篩查出的COX－2－765G/C多態位點的PCR引物及其基因型分析均按文獻［3］進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，計量資料用均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗;基因型與疾病的危險程度用比值比(OR)及95%可信區間(95%CI)來表示;多組用方差分析，F檢驗。

2 結果

2.1 辨證分型情況 本組400例，肝胃不和型32例(8%)，脾胃虛弱型110例(27.5%)，脾胃濕熱型200例(50%)，胃陰不足型38例(9.5%)，胃絡瘀血型20例(5%)。表明辨證分型以脾胃濕熱型、脾胃虛弱型為主。

2.2 中醫證型COX－2－765G/C位點－分布情況 見表1。

表1 中醫證型COX－2－765G/C位點基因分布情況 例(%)

由表1可見，不同中醫證型檢測出基因表型比例不一，COX－2－765G/C位點基因型中，GG基因型以脾胃濕熱型為主，占45%，表明在GG基因型中脾胃濕熱型與其他各型比較差異有統計學意義(P＜0.05)。CC基因型以脾胃虛弱型為主，占17.5%，表明在CC基因型中脾胃虛弱型與其他各型比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 中醫虛證、實證COX－2－765G/C位點基因表現分布 見表2。

表2 中醫虛證、實證COX－2－765G/C位點基因表現分布 例(%)

由表2比較，實證組以GG為主，GG與GC、CC比較差異有統計學意義(P＜0.05)，GC與CC比較差異無統計學意義(P＞0.05)。虛證組以CC為主，CC與GG、GC比較差異有統計學意義(P＜0.05)，GG與GC比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

3.1 COX－2基因多態性與慢性胃炎的相關性

環氧化酶(COX)又稱前列腺素內氧化酶還原酶，是一種雙功能酶，具有環氧化酶和過氧化氫酶活性，是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶，從而在機體的生理和病理過程中發揮作用。COX包括COX－1和COX－2 2種異構體，它們分別有不同的基因編碼。人類COX－1基因位于9號染色體，COX－2基因位于1號染色體。基因結構不同決定了兩者結構和功能差異。COX－1和COX－2在氨基酸水平上有60%一致性，盡管兩者有相似酶活性，但其生物學功能卻不同［4－6］。COX－1為結構型表達基因，主要存在于血管、胃、腎等組織中，參與血管舒縮、血小板聚集、胃黏膜血流、胃黏液分泌及腎功能等調節，其功能與保護胃腸黏膜、調節血小板聚集、調節外周血管阻力和調節腎血流量分布有關［7］。COX－2是誘導型酶，參與病理條件下應激反應［8］。人類COX－2基因定位于染色體1q25.2－25.3，全長約8.3 kb，由10個外顯子和9個內含子構成，轉錄后形成4.5 kbmRNA，編碼604個氨基酸的開放閱讀框架，含有17個氨基酸殘基，在SDS－聚丙烯酰胺(SDS－PAGE)凝膠電泳上呈現2條帶，分子量為 72 000 和 74 000［9－10］，其中上游 5＇非翻譯區長約0.8 kb，含有一些與COX－2啟動子轉錄激活密切相關的轉錄調控序列，相關的順式作用元件主要有CRE/Ebox重疊區域(259/249)，NF/IL26結合位點(2132/124)和2個NF－κB結合位點(2445/2427和2223/2214)。生理狀態下，COX－2基因在絕大多數組織細胞中不表達，僅在腎和腦的部分組織中可見，只有在細胞內外廣泛的刺激下才誘導性表達。刺激COX－2表達的因素主要包括:生長因子和細胞因子［如分類血小板衍生因子(PD－GF)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(BFGF)等］、血清、促腫瘤劑、癌基因(如ras、V－rsc)及一氧化氮等。如在各種急性和慢性炎癥條件下，巨嗜細胞、單核細胞、上皮細胞、滑膜細胞和癌細胞呈COX－2陽性。COX－2表達的調控主要在轉錄水平上，即細胞受到生長因子和細胞因子、脂多糖、癌基因(如ras、KRAS)等各種刺激，經過一系列信號轉導，如G蛋白偶聯機制、組織型纖溶酶原激活劑(TPA)活化的蛋白激酶C介導的通路以及生長因子受體、Src活化的酪氨酸激酶介導的通路，而作用于COX－2的5＇端的調控序列，促進COX－2轉錄，從而誘導COX－2的表達［11］。目前，一些相關研究發現COX－2蛋白在慢性胃炎、腸組織轉化和不典型性增生均有過度表達［12］。本研究發現COX－2啟動子區存在765G/C單核苷酸變異，這些變異可能與慢性胃炎發病風險相關。但需進一步證明攜帶765G/C等位基因COX－2表達量。

3.2 COX－2基因多態性與慢性胃炎中醫證型的相關性 證候研究一直是中醫領域研究熱點，有學者對中醫證候與基因多態性相關性進行理論研究［13－15］。證作為機體對致病因素作出反應后所處一種功能狀態，與致病因素性質及強弱有關，即中醫所謂同病異證、異病同證。基因組學認為，基因表達差異及基因序列多態性決定個體差異，個體體質多樣性決定了個體對內外環境的影響，從而表現出各種證的差異性，故我們認為基因多態性與中醫證候之間存在必然聯系。觀察結果顯示，COX－2－765G/C、基因型頻率在中醫各證型中存在差異，COX－2－765G/C基因多態性與慢性胃炎脾胃濕熱型、脾胃虛弱型發生有相關性，在脾胃濕熱型慢性胃炎患者中以GG基因型為主，脾胃虛弱型患者中以CC基因型為主;實證與虛證比較發現，實證組GG基因頻率明顯增高，虛證組CC基因頻率明顯增高。提示通過COX－2基因多態性檢測，為慢性胃炎中醫辨證分型及虛實證提供理論依據。基因變異可能是慢性胃炎中醫虛實證發生過程的重要遺傳因素;COX－2－765G/C位點GG、CC基因頻率可能與慢性胃炎虛實辨證相關。

綜上所述，研究了 COX－2啟動子區－765G/C基因型與慢性胃炎中醫辨證分型間的聯系，但是否依據COX－2基因多態性作為慢性胃炎中醫分型依據或標準，以及不同COX－2基因表型對中醫辨證施治能否作為指導標準，還需要進一步研究證實，假如成立，這樣就會對慢性胃炎給予早期預防和干預治療，對提高人民群眾健康水平具有重大社會意義。

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