靈芝菌絲體液態發酵及多糖藥理活性研究進展

陶如玉，郝利民，*，陳 強，賈士儒，張黎明，王 旭

（1.中國人民解放軍總后勤部軍需裝備研究所，北京 100010；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

靈芝菌絲體液態發酵及多糖藥理活性研究進展

陶如玉1，2，郝利民1，2，*，陳 強1，賈士儒2，*，張黎明2，王 旭1

（1.中國人民解放軍總后勤部軍需裝備研究所，北京 100010；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

靈芝是一種珍貴的藥食兩用真菌，具有補中益氣、滋補強壯、扶正固本、延年益壽等功效。靈芝多糖是從靈芝子實體或液態發酵靈芝菌絲體中提取分離而獲得的多糖，具有抗腫瘤、免疫調節、保肝護肝、抗氧化、抗疲勞、清除自由基和抗衰老等藥理活性。本文對近年來靈芝的液態發酵過程中菌種選育、培養基和發酵條件優化以及靈芝多糖的藥理活性研究進行系統綜述。

靈芝菌絲體；液態發酵；靈芝多糖；藥理活性

靈芝（Ganoderma lucidum）別名“瑞芝”、“仙草”，屬于擔子菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬，是一種藥食兩用真菌。靈芝入藥在我國已有二千多年的歷史，漢代《神農本草經》認為，靈芝能夠益心氣、安精魂、補肝益氣、堅筋骨，列為上品。靈芝中含有多糖、三萜類化合物、核苷類、生物堿類和甾醇類等多種生物活性成分，具有抗腫瘤、免疫調節、抗氧化和清除自由基的作用，且對于慢性支氣管炎、冠心病、糖尿病、神經衰弱等疾病都有一定的療效[1]。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，大多數是以葡萄糖為主的雜多糖，僅含有少量的半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、鼠李糖等其他單糖[2]。長期以來，靈芝的主要來源是野外采摘和人工栽培。但是，野生靈芝資源短缺，人工栽培靈芝子實體的成本高、周期長、勞動強度大，且品質難以控制，易受季節、環境、區域、原料等因素制約。此外，人工栽培靈芝子實體主要采用熟 料短段木栽培法，需大量的木材，且對樹木的品質要求較高，易造成資源浪費和環境污染。而靈芝菌絲體液態發酵則具有原料來源廣、生產周期短、產量大、產品質量穩定等特點。因此，采用靈芝菌絲體液態發酵生產靈芝多糖，受到了人們的廣泛關注，并逐漸成為目前國內外工業化應用的重要手段。有報道[3]稱，通過菌絲體液體深層發酵生產的產品，苦味小，營養價值高，有效成分不低于子實體，甚至有些指標還高于子實體。

1 靈芝菌株選育

我國靈芝種類豐富，人工栽培和工業發酵的菌株相當多，現已有數百余株。采用液態發酵生產靈芝菌絲體及代謝產物，其菌株是保證活性成分穩定、高產和縮短生產周期的重要途徑[1]。因此，作為投產用的靈芝菌株，對其進行常規分離、篩選非常必要。臧晉等[4]針對赤芝G5.65、赤芝G22、赤芝GL-2、韓芝K-1等的產量進行比較，結果發現赤芝G22的菌絲體產量和總多糖產量最高，赤芝G5.65、赤芝GL-2次之，韓芝K-1最差。李忠等[5]對以上4株靈芝菌株在拮抗反應、菌絲生長狀況、生育期、子實體農藝性狀及產量等方面進行了對比實驗，篩選出了生長良好、孢子粉產量高、生物學效率高的優良菌株。王雁萍等[6]在添加Na2SeO3的培養基上篩選出富硒能力較強、菌體生物量及多糖產量較高的菌株。

從野生菌株中通過自然選育得到的菌株趨于穩定生長繁殖，表現為生長速率慢、生產能力低的特性，無法滿足工業化液態發酵生產的要求。因此，誘變育種和雜交育種等方法是最主要的育種手段。王天嬌等[7]通過原生質體單核化技術、雜交育種技術篩選出雜交菌株，通過動力學分析發現，雜交菌株對底物的利用和三萜產物的合成與親本菌體比較有較大的提高。董玉瑋等[8]對赤靈芝原生質體制備、再生及紫外誘變育種、篩選有機鍺高產菌株進行研究，最終選育出的3 株高產有機鍺誘變株，有機鍺含量分別比出發菌株提高了113.58%、105.87%、103.86%。高明俠等[9]采用靈芝原生質體電融合技術選育高產多糖菌株，選育的融合菌株生物量和多糖含量分別為17.52 g/L和1.88 g/L，均高于親本株。全衛豐等[10]采用化學融合方法對兩株不同性狀的靈芝菌株進行原生質體融合選育，篩選到一株高產菌株，其子實體、孢子粉中硒含量明顯高于親本，遺傳性狀穩定。朱芬等[11]對靈芝HG菌株進行原生質體紫外誘變處理，獲得了生長速率、菌絲干質量和三萜含量明顯高于出發菌株的誘變株。董玉瑋等[12]采用化學誘變劑氯化鋰誘變赤靈芝原生質體，篩選出高產三萜類菌株，其胞內、胞外三萜類產量分別比原菌株提高了461.72%和136.57%，且誘變菌株遺傳穩定性良好。

2 發酵培養基的篩選

靈芝菌絲體通過培養基來獲得生長繁殖和合成代謝產物所必需的營養物質。不同的培養基，能夠對菌絲體生長以及活性成分的積累產生不同的影響。因此，對于靈芝菌絲體的發酵培養基科學界已經進行廣泛的研究。

2.1 碳源

碳源是藥食用真菌的主要營養成分之一。靈芝菌絲體可利用單糖、雙糖和多糖作為碳源，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、玉米粉、淀粉等。譚才鄧等[13]研究表明以2%的麥芽糖為碳源時，靈芝菌絲體多糖產量最高，可達6.64%。鄧功成等[14]研究多糖、雙糖和單糖對靈芝菌絲體生長的影響，結果發現靈芝菌絲體對可溶性淀粉的利用最好，玉米粉次之，而在供試的雙糖中，靈芝菌絲體對蔗糖的利用最好。劉冬等[15]對15 種碳源進行了比較研究，發現最適碳源單糖為葡萄糖，二糖為蔗糖，多糖為玉米粉，且靈芝菌絲體在液體培養基中的生長速度以在葡萄糖培養基中最快，蔗糖次之，多糖最慢。此外，有研究表明復合碳源更有利于菌絲體的生長和代謝產物的合成。楊德等[16]的研究結果表明以玉米粉水解液為碳源發酵得到的靈芝菌絲體生物量最大，而靈芝菌絲體多糖產量最高的是麥芽糖和玉米粉復合碳源。Chang Mingyao等[17]亦研究了多種碳源對靈芝液態發酵的影響，結果表明以紅糖和麥芽提取物為復合碳源時，靈芝菌絲體生物量和胞外多糖產量最高。Xu Peng等[18]研究了碳源對靈芝菌絲體生物量和三萜酸產量的影響，結果發現葡萄糖有利于菌絲體生長，玉米粉有利于三萜酸的積累，而以兩者作為復合碳源時菌絲體生物量和三萜酸產量與對照組相比分別提高了18%和64%。此外，碳源的濃度亦會影響菌絲體生物量和胞外活性物質的產量。靈芝液態發酵屬于低糖發酵，若培養基中糖濃度過高，就會導致滲透壓過高，菌絲體中的水分就會擴散到溶液中，進而造成細胞脫水死亡[19]。研究表明，靈芝菌絲體液態發酵培養基中碳源的最佳配比為2%～5%[20]。

2.2 氮源

氮源是提供微生物生長繁殖所需氮元素的營養源，是構成菌絲體蛋白質、核酸等生命物質的主要成分，是微生物的主要營養物質。由于有機氮源在經酶解處理后不僅可以提供氮源，還可提供碳源和某些微量元素，更有利于胞內多糖的合成與積累。因此與無機氮源相比，靈芝能夠更好地利用蛋白胨、酵母粉、酵母膏以及黃豆餅粉等有機氮源[21]。余以剛等[22]研究證明，以豆粕粉為氮源培養靈芝菌絲體得到的菌絲體生物量和胞外粗多糖產量分別為4.242 g/L和0.782 g/L，是無機氮源硫酸銨的2 倍。Fang Qinghua等[23]研究表明，以蛋白胨和酵母膏復合氮源培養靈芝，可增加胞外多糖和三萜類化合物的產量。此外，碳氮比對靈芝液態發酵培養亦有很大的影響，適宜的碳氮比，能促進菌絲體生長和代謝產物的大量合成，一般碳氮比應控制在（20～25）∶1左右[1]。氮源濃度應控制在0.1%～0.3%，氮源濃度過低時，所產多糖多為低分子質量多糖，而氮源濃度過高時則會抑制菌絲體生長和胞外代謝物的合成[24]。

2.3 無機鹽離子

在靈芝發酵過程中，影響菌絲體生長和胞外產物合成的基本元素主要有磷、鉀和鎂。其中，磷和鉀與糖代謝過程有關，鎂離子與碳源的氧化相關[25]。Hsieh等[24]研究發現磷酸鹽缺乏將明顯降低胞外多糖的產量，鎂離子含量過低則會產生較低產量的大分子質量多糖，鈣離子一般可用于調節pH值，且靈芝可將硒和鋅等無機態的礦質元素生物富集，進而轉化成有機態的礦質元素，更易于人體吸收。余素萍等[26]研究證明培養基中KH2PO4和MgSO4的添加量分別為0.15%和0.225%時，可滿足菌絲體生長需要。葉盛權等[27]研究不同金屬離子對靈芝多糖含量的影響，發現K＋、Mg2＋和Fe2＋可以促進靈芝多糖液態發酵，其中含Fe2＋的培養基所產生物量和多糖最多，分別為7.299 g/L和0.720 g/L。姚強等[28]研究了鑭（La）、鈰（Ce）、釹（Nd）、鐠（Pr）、鉺（Er）等5 種稀土元素對靈芝液體發酵的影響，結果表明適當質量濃度的稀土元素可顯著提高靈芝多糖和三萜的產量，其中稀土元素鐠對靈芝胞內多糖、 胞外多糖和胞內三萜合成的促進作用最明顯，而鑭元素對胞外三萜合成的誘導效果最好。

2.4 生長因子及促進劑

在靈芝發酵培養基中添加適量的維生素類物質，特別是VB1，可促進菌絲體的生長和胞外多糖的合成。譚才鄧等[13]研究發現，VB1對靈芝菌絲生長與多糖含量影響較大，且VB1的最佳使用量為0.1%。此時，菌絲生物量和多糖產量均達到最高，使用量過低或過高時，均不利于菌絲生物及多糖的產生。胡煥榮[19]研究發現在培養基中添加50 mg/L的VB1，能夠促使菌絲體生長粗壯。陳芳莉等[29]分別向培養基中添加0.001 g/L的VC、VB1、VB2、VB6，探討不同維生素對菌絲體生長和產胞外多糖的影響，結果表明VB2和VB6均能促進菌絲體生長，且能夠提高胞外多糖的產量，VB2較VB6更為明顯。

添加一定量的促進劑如植物油、中藥提取物、茶葉提取物等可以促進靈芝菌絲體生長并提高胞外代謝物產量。Yang Hailong等[30]在靈芝液態發酵培養基中添加了2%的薏米油，結果發現生物量、三萜類、胞外多糖和胞內多糖產量分別提高了2.34、1.76、1.2、1.23 倍。劉媛等[31]觀察了中藥對靈芝液態發酵過程中生物量和靈芝酸的影響，結果證明添加金銀花、淡豆豉、淡竹葉、連翹和甘草對靈芝菌的生長及靈芝酸的產生均有一定促進作用；薄荷、蘆根對靈芝菌生長有促進作用，但不能促進靈芝酸的產生。高佳佳等[32]通過添加紅茶對靈芝菌液態發酵影響的研究表明，培養基中添加紅茶對胞外多糖產量的提高有顯著的促進作用，比對照組增加80.2%；而菌體干質量則比對照組下降43.6%。

3 發酵條件的研究

對于靈芝液態深層發酵，除了要供給足夠的營養外，發酵過程中適宜的培養條件（如pH值、溫度、接種量和培養時間等），對菌絲體生長和胞外多糖合成，也起著至關重要的作用。

3.1 pH值

靈芝菌絲體喜歡偏酸性的培養條件，在pH值為4.5～8.0范圍內均能生長[20]，菌絲體生長的最適pH值為5～6[1]。初始pH值不同，會對胞外代謝產物和菌體生物量有較大的影響。李平凡等[33]考察了發酵過程控制不同pH值對發酵水平的影響，結果發現pH值控制在4.5～5.0時，多糖產量和菌體量均為最高。余素萍等[34]以不同初始pH值培養基搖床培養菌株G7菌絲體，其多糖含量在初始pH 3～8范圍內變化不大，當pH值大于8時，菌絲體多糖含量下降。Fang Qinghua等[35]研究表明，培養基初始pH值為3.5～6.5時，可產生較多的胞外多糖和胞內多糖。Leandro[36]研究了初始pH值對靈芝液態發酵胞外多糖產量的影響，結果發現pH值為3.5時胞外多糖產量達到最高值。

3.2 溫度

溫度是菌絲體中酶反應的必需條件，在高溫條件下酶反應快，菌絲體生長快，但菌絲體容易衰老，不易積蓄多糖；在低溫條件下，各種酶反應不協調，菌絲體停止生長[19]。靈芝菌絲體在22～35 ℃的溫度范圍內均可生長，但其生長最適溫度范圍是27～30 ℃[1]。陳芳莉等[29]應用不同的溫度培養赤芝，發現28 ℃是其菌絲體生長的最佳溫度。喬雙逵等[37]研究發現，溫度為30 ℃時發酵液中多糖產量較高，且此條件下獲得的多糖對小鼠肝癌細胞Hepa 1-6和人乳腺癌細胞MDA-MB-231具有更高的抑制作用。

3.3 接種量和菌齡

接種量的大小決定著菌種的生長速率。接種量過小，菌種生長速率慢、發酵周期長；接種量過大，菌絲老化快，影響胞外多糖的產量[1]。楊焱等[38]研究了接種量對發酵赤芝G2菌絲體生物量的影響，綜合考慮培養基的利用率和培養周期后，確定最佳接種量為10%。Fang Qinghua等[39]研究了不同接種密度（70～670 mg/L，以干質量計）對靈芝液態發酵產胞外代謝物的影響，結果表明接種密度大時胞外多糖產量較高，接種密度小時胞外三萜類化合物產量較高。

菌齡對菌絲體生長和胞外多糖合成也同樣重要。菌齡太短，往往出現前期生長緩慢、發酵周期延長；菌齡過長，則會引起菌絲體過早自溶，導致 生產能力下降。二者均不利于菌絲體的生長及代謝產物的合成，一般認為最佳菌齡為4～5 d[40]。

3.4 培養時間

靈芝發酵過程中不同的培養時間形成的產物不同，發酵76 h菌絲體生物量最高（1.15 g/100 mL）；發酵62 h胞內多糖含量最高（22.15%）；發酵60 h胞外多糖含量最高（3.16%），因此選擇合適的培養時間非常重要[25]。余素萍等[34]研究發現，培養G7菌株60 h菌絲多糖產量最大；培養96 h生物量最大。徐濟責[41]研究表明，綜合考慮菌絲密度和生物轉化率，最佳培養時間應為5 d。發酵培養時間也會影響靈芝多糖的抗氧化活性。Chien等[42]研究結果表明，發酵5 d時得到的多糖清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力顯著增強。

4 靈芝多糖藥理作用

靈芝多糖是靈芝的主要有效成分，現已證明靈芝多糖具有抗腫瘤、免疫調節、抗氧化、清除自由基、抗衰老等功效，能夠輔助治療動脈粥樣硬化、糖尿病、神經衰弱等多種疾病。

4.1 抗腫瘤

近年來，靈芝多糖的抗腫瘤作用是國內外的研究熱點。大量研究表明，靈芝多糖雖可抑制腫瘤細胞生長，但不直接具有細胞毒性[1]。靈芝多糖是通過增強機體的免疫作用來抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡，從而發揮其抗腫瘤作用。Zhang Jue等[43]將靈芝菌絲體液態發酵胞外多糖進行硫酸化并研究其抗腫瘤活性，發現硫酸化的靈芝多糖能夠顯著的抑制肝癌細胞株HepG2的增殖與擴散。Soniamol等[44]研究靈芝多糖在體內對埃里希腹水癌細胞的抑制作用，結果證明在移植癌細胞后注射100 mg/kg靈芝多糖，癌細胞的體積和質量分別減少80.8%和77.6%，而在移植癌細胞前注射等劑量的靈芝多糖，癌細胞的體積和質量分別減少79.5%和81.2%。Ma Chungwah等[45]研究證明了靈芝多糖能夠很好地抑制鼠嗜咯細胞瘤細胞PC12的生長，其機理是增強巨噬細胞的增殖和胞飲作用，從而抑制腫瘤細胞的增殖和擴散。

4.2 免疫調節

人體免疫系統可以抵御外來細菌、病毒等有害物質的侵襲，能夠清除體內衰老、突變、惡化或死亡的細胞。靈芝多糖作為生物反應調節劑，不僅能夠激活T、B淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞等免疫細胞，還能促進細胞因子的生成，全面發揮對機體的調節作用。許曉燕等[46]研究靈芝對正常小鼠免疫功能的影響，結果表明靈芝能夠顯著地增強正常BALB/c小鼠遲發型變態反應免疫、抗體生成免疫、單核-巨噬細胞免疫能力以及NK細胞活性，促進小鼠血清溶血素產生，增強其免疫系統的功能。Shi Min等[47]研究發現靈芝多糖對巨噬細胞RAW 264.7的擴散有明顯的促進作用影響，多糖質量濃度為40 ?g/mL時，RAW 264.7細胞的擴散比對照組增加了55%。

4.3 抗氧化和清除自由基

自由基是代謝過程中產生的活性物質，機體內自由基過多，會引起氧化反應，導致細胞、組織和器官的損傷，并誘發多種疾病，加速機體衰老[48]。靈芝多糖作為一種天然抗氧化劑，能夠清除體內過多的自由基，維持機體穩態[1]。靈 芝多糖對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基，均具有較好的清除作用，3 mg/mL的多糖溶液對3 種自由基的清除率分別為70%、90%和85%[49]。謝韶瓊等[50]探討了靈芝多糖對H2O2誘導的角質形成細胞氧化應激性損傷的保護作用，靈芝多糖可減少H2O2誘導角質形成細胞丙二醛沉積，增加抗氧化酶活性，從而起到保護作用。

4.4 其他藥理作用

現代藥理學研究證明，靈芝多糖除了上述藥理作用外，還可治療神經系統、心血管系統等疾病[1]。郭燕君等[51]研究靈芝多糖對Aβ25-35誘導阿爾茨海默病模型大鼠腦組織的影響，結果表明靈芝多糖對Aβ25-35誘導阿爾茨海默病模型大鼠腦組織內海馬退行性變神經元有一定的保護作用，并能降低腦組織內的神經炎癥反應。吳鋒[52]的研究發現，靈芝多糖具有防止大鼠動脈粥樣硬化的作用，認為其機制可能與調節血脂障礙有關。靈芝不僅可以用來治療各種疾病，還可用于疾病的預防。通過靈芝的穩態調節，改善人體對內、外界環境的適應能力，即可預防中老年的常見病、多發病。

5 結 語

采用液態發酵培養靈芝菌絲體，在一定程度上克服了野生靈芝和人工栽培靈芝的局限性，因此成為了國內外關注的熱點。目前，關于靈芝液態發酵的研究主要集中于優良菌株的選育、培養基的篩選、培養條件的優化以及發酵工藝的改良，提高了靈芝菌絲體液態發酵的技術水平。但研究中仍存在著一定的問題：一方面靈芝菌株種類繁多，其產物的藥理活性存在著差異，且生產上對菌株的質量要求較高，需篩選出適合工業化生產且產物藥理活性較高的菌株；另一方面，目前工業生產中采用的分離、純化多糖的方法需添加大量的有機試劑，易造成多糖的損失，破壞其藥理活性，且有機試劑去除困難，應研究和開發更為簡便、安全、有效的分離、純化工藝。

靈芝多糖是自然界天然存在的一種多糖類物質。現代藥理學研究表明，靈芝多糖具有抗腫瘤、免疫調節、抗氧化、清除自由基、抗衰老等功效，對腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病以及神經衰弱等多種疾病的治療及預防有重要的作用。靈芝多糖藥理活性的研究雖已進入細胞、分子和基因水平，但尚需關注以下幾個方面：一是，關注靈芝多糖的構效關系、代謝途徑、生理活性及其作用機制的研究，尤其是對多糖活性中心的研究；二是，關注靈芝多糖化學修飾法及相關多糖衍生物新功能的研究，不斷發掘多糖來源及其新功能；三是，關注靈芝多糖與其他天然產物的協同效應，進一步拓展多糖的應用領域和使用范圍。通過對靈芝多糖的結構、活性、代謝途徑、作用機制、化學修飾方法及其衍生物功能等方面的系統研究，將為靈芝多糖在食品和醫藥領域的應用與開發奠定扎實基礎，指明新的方向。

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Recent Progress in Pharmacological Activities of Polysaccharides from the Mycelia of Liquid-Cultured Ganoderma lucidum

TAO Ruyu1，2， HAO Limin1，2，*， CHEN Qiang1， JIA Shiru2，*， ZHANG Liming2， WANG Xu1
(1. Institute of Quartermaster Equipment， General Logistics Department of People’s Liberation Army， Beijing 100010， China; 2. College of Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China)

Ganoderma lucidum is a mushroom widely used in China as a traditional Chinese medicine and healthy food for thousands of years due to its promotion of longevity and health. Polysaccharides extracted from fruit bodies or liquidcultured mycelia of G. lucidum have anti-tumor， immune-improving， liver-protecting， ant i-oxidation， anti-fatigue， free radical scavenging and anti-aging functions. In this paper， we provide a systematic review of studies on strain breeding and culture medium and conditions optimization for the production of G. lucidum polysaccharides as well as their pharmacological activities.

Ganoderma lucidum mycelia; liquid-state fermentation; Ganoderma lucidum polysaccharides; pharmacological activity

TQ920.1

A

1002-6630（2015）09-0260-05

10.7506/spkx1002-6630-201509048

2014-12-23

全軍重點科研項目（AX110C002）

陶如玉（1988—），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。E-mail：taoruyu5212@126.com

*通信作者：郝利民（1969—），男，教授，博士，研究方向為軍用功能食品。E-mail：hlm2005@163.com賈士儒（1954—），男，教授，博士，研究方向為發酵工程原理。E-mail：jiashiru@tust.edu.cn