大孔樹脂分離土茯苓黃酮的研究

隋欣，暴悅梅

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

大孔樹脂分離土茯苓黃酮的研究

隋欣，暴悅梅

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

通過測試樹脂對土茯苓黃酮的吸附率、吸附速率、解吸率和產物得率及其黃酮含量，比較了5種不同類型吸附樹脂對土茯苓中黃酮的吸附特性。結論5種樹脂中D101樹脂對土茯苓總黃酮的吸附效果最好，吸附量可達18.32mg/g，X-5次之，吸附量達18.09mg/g。動態柱吸附后，使用50%乙醇作為洗脫劑可以將被樹脂吸附的黃酮全部洗下，用量為3.5倍柱體積。通過本工藝，2 kg土茯苓獲得總黃酮6.27 g，得率為0.31%。經HPLC分析，總黃酮中落新婦苷含量為90.54%。

大孔樹脂；黃酮；土茯苓；落新婦苷

土茯苓為百合科植物光葉菝葜的干燥根莖，具有除濕，解毒，通利關節之功效[1]。主產于廣東、湖南、安徽、湖北、浙江、四川等省[2]，化學成分研究表明，土茯苓中含有落新婦苷、白黎蘆醇、異黃杞苷、異落新婦苷、柚皮素等多種成分[3-4]，其中二氫黃酮醇苷類（如落新婦苷）為土茯苓的有效成分[5]。近年來臨床和藥理試驗表明，落新婦苷具有較強的抗炎、鎮痛、利尿作用[6-7]。分離純化高純度的土茯苓黃酮對新藥的開發有著重要意義。

實驗以土茯苓為原料，采用大孔樹脂分離純化其所含的黃酮成分。通過分析D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5 5種大孔樹脂的靜態吸附試驗，計算樹脂的單位飽和吸附容量Q，以此篩選較優樹脂做后續動態吸附和解吸試驗，以確定此樹脂分離純化土茯苓黃酮的最佳工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料

土茯苓中藥飲片購買于廣西康美藥業股份有限公司。D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5大孔吸附樹脂購于鄭州勤實科技有限公司。

1.2 主要試劑

乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純）：以上均購于天津永大化學試劑有限公司；落新婦苷標準品：上海同田生物科技有限公司；乙腈（高效液相色譜純）：TEDIACompany，USA。

1.3 儀器

Q-350B3型粉碎機：上海冰都電器有限公司；BSA124S型電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；HF-20B型超聲提取器：北京弘祥隆生物技術有限公司；754PC型紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司；SSC300NA型三足式離心機：張家港市永泰離心機制造有限公司；RE 52-05型旋轉蒸發儀、SHZ-ШD型真空泵：上海亞榮生化有限公司；TGL-16B型離心機：上海安亭科學儀器廠；Waters高效液相色譜儀：美國WATERS公司；FD-1-50真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗設備有限公司。

2 試驗方法

2.1 土茯苓的預處理

揀選優質康美土茯苓飲片置于粉碎機中進行粉碎，過40目篩網得土茯苓粉末，裝入密封袋后低溫密封保存。

2.2 樹脂的預處理

用無水乙醇浸泡并充分溶脹樹脂一夜，用大量蒸餾水洗去乙醇至無醇味，然后分別用體積分數為2%的HCl溶液、質量分數為2%的NaOH溶液浸洗樹脂各一夜，再用蒸餾水洗至中性，抽濾后密封存放備用。

2.3 標品溶液的配制

將落新婦苷標準品置于干燥箱中105℃干燥至恒重，精密稱取干燥后的落新婦苷標準品5 mg，置于50mL容量瓶中，以極少量的甲醇將落新婦苷溶解后，添加蒸餾水至刻度線，配成0.1mg/mL的標準品溶液，搖勻備用。

2.4 土茯苓樣品高效液相色譜分析

稱取土茯苓粉末0.5 g，加入甲醇25mL，室溫下超聲提取30min，取上層提取液用蒸餾水適當稀釋，經0.45μm有機系膜過濾備用。梯度洗脫方法見表1。

2.5 土茯苓總黃酮的提取

稱取干土茯苓粉末2 kg于超聲提取器中，加入20 L體積分數為60%的乙醇溶液；設定好各項工作參數：超聲提取總時間為45min，超聲間隙為3 s，攪拌速度為800 r/min，超聲溫度為30℃。超聲完成后取出混合液，經三足式離心機將土茯苓粉渣和提取溶劑相分離，棄去粉渣，所得提取液置于旋轉蒸發儀中進行濃縮（濃縮溫度為55℃），直至乙醇全部蒸出，對余下液體離心（轉速為4 000 r/min），棄去沉淀，收集上清液。

2.6 大孔樹脂吸附土茯苓中的黃酮

2.6.1 樹脂的靜態吸附和篩選

準確稱取經預處理的樹脂D101，NKA-9，AB-8，H103和X-5各1 g裝入100mL的具塞磨口三角瓶中，加入50m L稀釋后總黃酮濃度為430μg/m L的土茯苓提取液，置于20℃搖床內搖蕩，每隔15分鐘用移液槍吸取少量樣液，樣液經稀釋后于291 nm下檢測吸光度，以吸附時間為橫坐標，吸附率為縱坐標，繪制靜態動力學吸附曲線。待樹脂充分吸附后，測定樣液吸附平衡時總黃酮的最終濃度，計算樹脂的單位飽和吸附容量Q。通過比較不同樹脂的飽和吸附量，篩選出較優的大孔樹脂。

2.6.2 樹脂的動態吸附與解吸

由樹脂的靜態吸附試驗，對篩選出的一種理想樹脂，進行動態吸附與解吸試驗。把預處理好的樹脂濕法裝入15mm×500mm玻璃色譜柱中（柱高31 cm，柱床體積約為55mL），將稀釋后的土茯苓總黃酮提取液（430μg/mL）以10mL/min速度上柱，直至吸附完全。樹脂柱分別用10 0mL純化水洗脫，可洗去水溶性雜質糖和蛋白質等，再依次用20%，50%，80%乙醇各250mL以3mL/min流速洗脫，收集洗脫液紫外檢測土茯苓中的落新婦苷。分別對洗脫液進行HPLC分析。通過以上小試試驗確定最佳洗脫溶劑和洗脫量。最后通過中試試驗來收集土茯苓落新婦苷洗脫液。

3 結果與討論

3.1 紫外檢測波長的選擇

取土茯苓提取液和落新婦苷標準品溶液，進行適當稀釋后置于石英比色皿中，以各自試劑空白為參比，在波長200 nm～400 nm范圍內掃描，發現落新婦苷在291 nm處有最大吸收峰，因此選擇291 nm作為測定波長。圖1和圖2分別為樣品溶液和標準品溶液紫外掃描圖譜。對比圖1和圖2可知，土茯苓提取液和落新婦苷紫外吸收圖譜基本一致，這是因為土茯苓提取液中所含成分和落新婦苷均為黃酮類化合物，具有明顯的紫外吸收光譜特征，它們在291 nm下具有最大吸收波長，濃度與吸光強度變化遵循朗伯比爾定律，土茯苓中總黃酮濃度以落新婦苷濃度計量。

3.2 標準曲線的繪制

精密量取落新婦苷標品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、 2.0、2.4mL分別置于刻度為10mL的試管中，依次加蒸餾水至10mL，搖勻，以蒸餾水做空白。在291 nm處測量以上各溶液的吸光度，以落新婦苷的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，見圖3，得標準曲線的方程為Y=41.179X＋0.028 3，R2=0.999 7，濃度在0mg/mL～0.024mg/mL之間呈良好的線性關系（見圖3）。

3.3 樹脂的靜態吸附結果

3.3.1 樹脂的靜態吸附動力學曲線

在20℃搖床中，考察了D101、NKA-9、AB-8、H103和X-5 5種樹脂對土茯苓總黃酮吸附率和吸附時間的關系，繪出了靜態吸附動力學曲線，其結果如圖4所示。

由圖4可知，D101對土茯苓總黃酮的吸附速度最快，X-5與D101吸附速率相當；D101、NKA-9、AB–8和X-5在2.5 h內基本達到平衡，而H103在4 h內還未達到平衡。

3.3.2 樹脂的篩選

在相同的條件下，吸附樹脂的種類不同，吸附能力也有所不同。不同種類樹脂吸附能力的差異是由于樹脂表面積的大小及其極性存在差異。按公式（1）計算樹脂的單位飽和吸附容量Q（見表3）。

式中：Q為吸附率，（mg/g）；C0為初始濃度，（mg/mL）；Cr為剩余濃度，（mg/m L）；V為溶液體積，m L；W為樹脂質量，g。

試驗表明，大孔樹脂D101對總黃酮的吸附容量最大，為每克干樹脂18.32mg/g，選擇D101大孔樹脂做后續實驗。大孔樹脂D101是非極性樹脂，其孔表疏水性較強，可通過與小分子內的疏水部分的作用吸附溶液中的有機物，最適于極性溶劑中吸附非極性物質。

3.4 樹脂的動態吸附及解吸結果

根據樹脂靜態吸附試驗，我們選取D101做后續試驗，對D101樹脂動態吸附落新婦苷和解吸進行研究。結果表明當用20%的乙醇洗脫樹脂柱時，其他黃酮成分及部分落新婦苷能被洗脫下來；當用50%的乙醇洗脫樹脂柱時，大量落新婦苷被洗脫下來；當用80%的乙醇洗脫時，液相圖中未見落新婦苷出峰，說明樹脂柱中的黃酮已被完全洗脫。

通過以上試驗，確定土茯苓黃酮的純化步驟為：先用2倍柱體積純凈水洗去水溶性雜質糖和蛋白質等，再用50%乙醇洗脫樹脂柱上的總黃酮。圖5為50%乙醇洗脫曲線。

由圖5可知，在乙醇用量為柱體積的0.5倍～1.2倍時，隨著乙醇用量的加大，流出液中黃酮的含量逐漸增加；當乙醇用量繼續加大時，流出液中黃酮的濃度又逐漸的降低；當乙醇用量為柱體積的3.5倍左右時，已基本將黃酮洗凈。因此最終確定，50%乙醇用量為3.5倍柱體積。

3.5 純化產物的HPLC分析

對步驟2.6收集到的土茯苓黃酮粗品進行HPLC（見圖6）分析可知，黃酮中主要成分落新婦苷的純度可達90.54%。2 kg土茯苓經D101大孔樹脂分離純化后可得6.27 g土茯苓黃酮，得率為0.31%。

4 結論

本試驗對土茯苓中黃酮成分的分離純化進行了研究，發現D101、NKA-9、AB-8、H103、和X-5這5種樹脂，D101對土茯苓總黃酮的吸附效果最好，吸附量可達18.32mg/g，而X-5其次，為18.09mg/g。樹脂柱洗脫時，先用2倍柱體積純凈水洗去水溶性雜質糖和蛋白質等，再用50%乙醇洗脫樹脂柱上的黃酮成分，洗脫用量確定為柱體積的3.5倍即可。洗脫液經濃縮、冷凍干燥后得到土茯苓黃酮中落新婦苷的含量為90.54%。經上述工藝步驟，2 kg土茯苓共得6.27 g土茯苓黃酮，得率為0.31%。該工藝步驟簡單，得率較高，是一種值得推廣的土茯苓黃酮提取工藝。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學工業出版社,2005:14-15

[2] 李玉蓮,李玉琪,曾平,等.土茯苓植物資源調查[J].中草藥,2002,33 (9):850-852

[3]陳廣耀,沈連生,江佩芬.土茯苓中二氫黃酮醇甙的研究[J].中國中藥,1996,21(6):355

[4]陳廣耀,沈連生,江佩芬.土茯苓化學成分的研究[J].北京中醫藥大學學報,1996,19(1):44

[5]陳紅梅,秀蘭,吳占全.土茯苓的化學與藥理研究進展[J].中國民族醫藥,2008(11):71-73

[6] 張白嘉,劉亞歐,劉榴,等.土茯苓及落新婦苷抗炎、鎮痛、利尿作用研究[J].中藥藥理與臨床,2004,20(1):11-12

[7] 吳麗明,張敏.土茯苓中落新婦苷的利尿和鎮痛作用[J].中藥材, 1995,18(12):627-630

Study on the Separation of Glabrous Greenbrier Rhizome Flavonoids by Macroporous Resin

SUIXin，BAOYue-mei
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Through the test of resin adsorption on Glabrous Greenbrier Rhizome flavonoids， adsorption rate，ratio of desorption， the yield rate and the content of flavonoid， Compared the adsorption characteristic of 5different kinds of adsorption resins for flavonoids from Glabrous Greenbrier Rhizome. The best adsorption effectof five kinds of resin and D101 resin for total flavonoids in Glabrous Greenbrier Rhizome， adsorption capacitywas 18.32 mg/g， and the X-5 followed， 18.09 mg/g. After the dynamic column adsorption， flavonoids using50 % ethanol as eluant can be adsorbed by the resin eluted all yieid， the amount of 3.5 times the columnvolume. Through this process， 2 kg Glabzons Greenbiere Rhizowe 6.27 g flavonoids， yield 0.31 %. By theanalysis of HPLC， total flavonoids astilbin content was 90.54 %.

macro-reticular resin；flavonoid；Glabrous Greenbrier Rhizome；Astilbin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.012

2015-01-08

隋欣（1982—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品微生物檢測。