甲殼動物、昆蟲、真菌中甲殼素的提取進展

李彥艷，張閃閃，任國棟

（河北大學生命科學學院，河北保定071002）

甲殼動物、昆蟲、真菌中甲殼素的提取進展

李彥艷，張閃閃，任國棟

（河北大學生命科學學院，河北保定071002）

甲殼素/殼聚糖是一種應用廣泛可降解高分子材料，廣泛存在于蝦蟹殼、昆蟲外骨骼、真菌細胞壁。隨著甲殼素在醫學、食品等方面的研究，甲殼素越來越受到國內外研究者重視。傳統生產甲殼素的方法是利用蝦蟹殼作為原料，蝦蟹殼中甲殼素含量為20%～30%，方法主要包括傳統的化學酸堿法，EDTA法及最近幾年發展的酶法等。近年來資源昆蟲和真菌成為研究開發的重點。從昆蟲中提取甲殼素多采用酸堿法，但又不同于從蝦蟹中提取方法。在真菌中，甲殼素和殼聚糖相互緊密交織存在于細胞壁中，通常以蝦蟹殼中用酸堿法提取甲殼素的方法為基礎，作一些改進。針對甲殼素來源不同的特點，介紹了制備甲殼素的不同工藝，為綜合開發利用資源提供了參考。

甲殼素；殼聚糖；甲殼動物；昆蟲；真菌

甲殼素，又名幾丁質、甲殼質，是N-乙酰氨基葡萄糖經過β-1，4糖苷鍵連接的直鏈多糖，是自然界中儲存量僅次于纖維素的第二大天然多糖，殼聚糖是甲殼素脫乙?；谩ぞ厶蔷哂袩o毒，可生物降解，生物粘附性，并具有抑菌、抗腫瘤等活性，因此廣泛應用于農業、食品、醫藥、生物工程等領域。

自然界中甲殼素來源廣泛，存在于甲殼動物外殼、昆蟲體壁和真菌細胞壁中。甲殼動物外殼含有大量的甲殼素，蝦蟹殼中含量達10%～30%。蝦蟹殼因為其穩定的來源，一直是生產甲殼素的主要原料。我國蝦蟹殼年產量在1000多萬t左右，甲殼素產量超3萬t。從蝦蟹殼里制備甲殼素的傳統方法是酸堿法，一般有酸浸脫鹽（主要為鈣鹽）、堿煮脫蛋白和氧化脫色三步[1]。目前，國內大都采用蝦、蟹殼作為原料制備殼聚糖，但由于其來源有限、殼聚糖含量低、灰分含量高，提取成本相對較高，使其應用受到一定限制。昆蟲中甲殼素含量可達20%～60%，已經有許多昆蟲被我們利用，如蟬蛻、蠅蛆、蠶蛹、蜜蜂等。甲殼素存在于昆蟲的體壁，而昆蟲的體壁形成是骨化過程，不同于蝦蟹的鈣化過程，體壁中只含有少量無機鹽，這使從昆蟲中制備甲殼素相對簡單。而且昆蟲易于實現人工養殖，不受季節和環境的限制。另一類可供人類使用的資源就是真菌，甲殼素是絕大多數真菌細胞壁的組成成分，含量不一，有的高達45%。甲殼素和殼聚糖相互緊密交織存在于細胞壁中，通常采用稀堿除去菌絲表面的蛋白質等物質，將含有甲殼素和殼聚糖的細胞壁暴露出來，再用酸浸和堿沉淀即可得到甲殼素和殼聚糖。目前關于甲殼素提取的研究已有很多，但是要想更好應用這種材料，提取和制備品質優良的甲殼素/殼聚糖成為研究的首要問題。本文對不同來源的甲殼素制備工藝和方法作一綜述。

1 甲殼動物的甲殼素

這里所說的甲殼動物主要指蝦和蟹類。蝦蟹殼中甲殼素含量為10%～30%，無機物（碳酸鈣為主）含量為40%，其他有機物（主要是蛋白質）含量為30%左右[2]。

1.1 酸堿法

何明等[3]以小龍蝦殼和北極蝦殼為原料制備了甲殼素與殼聚糖。采用同樣的方法：蝦殼收集，處理干凈；2 mol/L鹽酸浸泡脫鈣；10%NaOH煮沸除蛋白質；40%NaOH煮沸脫去部分乙酰基，制得殼聚糖。以小龍蝦殼為原料，甲殼素的產率為15.92%，殼聚糖的產率為10.84%；以北極蝦殼為原料，甲殼素的產率為17.25%，殼聚糖的產率為11.78%。

傳統酸堿法使用大量的酸堿，不僅消耗能源，還造成環境污染，在此基礎上對其改進顯得刻不容緩。朱凱等[4]先將原料粉碎，用復合脫脂劑脫脂，再經過酸浸、堿煮等，降低了酸堿的用量，也提高了甲殼素產品的質量。周宏亮[5]以南極磷蝦為原料，改變酸堿濃度和處理時間，制備了灰分含量較低的甲殼素。劉芳等[6]對對蝦加工副產品的綜合利用進行了初步探討，建立了一整套蝦頭、殼綜合利用工藝，最終獲取率甲殼素為24%，殼聚糖22%，氨基葡萄糖鹽酸鹽13%，還得到43%碳酸鈣，4.4%蛋白粉。楊丹等[7]采用EDTA代替鹽酸從蝦蛄殼制備了甲殼素，產率達24.83%，甲殼素的脫乙酰度為31.17%，相對分子質量為1.76×106。

1.2 酶法

楊錫洪等[8]探索以蝦頭制備殼聚糖的新工藝，采用紫外照射激活蝦頭內的自溶酶，利用酶水解脫除蛋白質替代傳統堿加熱處理法。Y.Xu等[9]以Penaeusmonodon和Crangon crangon shells為原料，采用發酵法制備甲殼素。厭氧細菌HP1產生的蛋白酶可除去蛋白；Lactobacillus caseiMRS1分解葡萄糖產生乳酸可脫除鈣鹽。經過生物降解，蛋白質含量分別由30%和10%降為5.8%和6.7%，而鈣含量由12%和18%降為0.4%和0.3%，甲殼素的產率為37%、30%，黏度為0.045Pa·s、0.135Pa·s。W.J.Jung等[10]也嘗試了用酶解法制備甲殼素和殼聚糖。利用Lactobacillus paracasei subsp.toleransKCTC-3074（L.3074）產生的乳酸除去蟹殼中的鈣鹽，Serratiamarcescens FS-3（FS-3）產生的蛋白酶除去蛋白質。蟹殼中灰分含量從41.16%降到1.15%，蛋白質含量由22.36%降到10.62%。

在制備低分子量的甲殼素和殼聚糖及其衍生物時，也常采用酶解法。Kwang Kim等[11]誘導Streptomyces griseus HUT 6037產生甲殼素酶和殼聚糖酶?？扇苄詺ぞ厶牵撘阴６葹?3%）可誘導甲殼質酶和殼聚糖酶[12]。利用此酶可制備低分子量的殼聚糖，在食品與醫藥領域有著更為廣泛的應用。K.Kadokura等[13]培養Vibrio parahaemolyticus誘導其產生甲殼質酶和甲殼素寡糖脫乙酰酶，可降解甲殼素和N-乙酰氨基葡萄六糖得到N-乙酰氨基葡萄二糖，N-乙酰氨基葡萄二糖是生物細胞內許多重要多糖的基本組成單位；是合成雙歧因子的重要前體；在臨床上治療風濕性及類風濕性關節炎；也可作為食品抗氧化劑及嬰幼兒食品添加劑。

我國蝦蟹的年產量達5 000萬t，蝦蟹殼年產量在1 000多萬t左右，對于水產加工來說，蝦蟹殼是固體廢棄物，而對于甲殼素生產它則是很好的原料。蝦蟹殼中的甲殼素含量較高，從蝦蟹殼中制備甲殼素，不僅處理了廢棄資源，還變廢為寶。我國早在20世紀80年代初就提出了蝦蟹殼的資源化處理法，經過多年的實踐，在酸堿法基礎上不斷對工藝進行優化，具備了一定的技術基礎，為實現產業化鋪平了道路。但也存在許多難題。一方面，傳統的化學酸堿法制備甲殼素造成能源浪費和環境污染，有價值的蛋白質遭受破壞不能作為資源而利用。雖然采用了一些比較溫和的工藝（如酶法），但還不太成熟。另一方面，蝦蟹殼含鈣量高，給提取造成困難，且由于制備方法和所用原料不同，得到的甲殼素樣品的溶解性、分子質量、脫乙酰度及黏度會有所不同[14]，產品的均一性差。

2 昆蟲的甲殼素

另一大類節肢動物主要就是昆蟲了，包括蟬蛻、蠅蛆、蜜蜂、蠶蛹等。昆蟲甲殼素的提取方法歸納起來為“四脫”，一脫蛋白質，二脫脂肪，三脫無機鹽，四脫色素。

2.1 從蟬蛻提取甲殼素

蟬蛻中的無機組分主要為碳酸鈣，有機組分為蛋白質、甲殼素及少量的色素，甲殼素的含量為10%～12%[15]。制備甲殼素的傳統方法是利用稀鹽酸脫鈣，堿煮脫蛋白，高錳酸鉀脫色。

鄢立剛等[16]采用酸堿法從蟬蛻中提取甲殼素，產率為34.3%，遠高于蝦蟹殼。經過蝦蟹殼甲殼素與蟬蛻甲殼素的質量對比分析，二者基本一致，分子中每結構單元含有1/2分子締合水，維持了甲殼素的天然特性。

2.2 從蠅蛆提取甲殼素

在自然界中，蒼蠅的繁殖能力位居第一，一對蒼蠅4個月可繁殖2660億個蠅蛆。干蛆含甲殼質30%～ 54.8%，高于蝦蟹中甲殼素的含量，蠅蛆成為資源昆蟲研究的重要方向之一。

以蠅蛆為原料制備甲殼素及其衍生物大多采用酸堿法。用蝦蟹為原料可制備高、中、低不同黏度的殼聚糖，而用蠅蛆為原料制備的是中、低黏度的殼聚糖。且蠅蛆殼聚糖在低重金屬離子含量、低灰分含量方面優于蝦蟹殼聚糖。我國擁有長達1.8萬公里的海岸線，沿海鹽場較多。在制鹽過程中，鹵蠅在鹽池中產卵、繁殖，大量的鹵蠅蛆殼漂浮于鹽池中，對制鹽業造成危害。王穩航等對[17]鹵蠅蛆殼進行綜合利用，制備了質量較高的殼聚糖，成品為白色，脫乙酰度為78.90%，黏度為1.12 Pa·s。

2.3 從蜜蜂提取甲殼素

S.V.Nemtsev等[18]研究以蜜蜂為原料制備甲殼素。蜜蜂中含有35%～45%蛋白質，23%～32%甲殼素，2%～3%無機化合物。采用酸堿法除去蛋白和鈣鹽，用H2O275℃脫色1 h可得甲殼素；將甲殼素在50% NaOH堿煮可得殼聚糖。殼聚糖的產率為16%～25%，脫乙酰度為75%～84%，黏度為3Pa·s～4.5Pa·s。

2.4 從其他昆蟲提取甲殼素

朱洪紅等[19]利用家蠶蛹皮制備甲殼素，以酸堿法為基礎，85℃下10%H2O2脫色0.5 h。甲殼素提取率為32%，灰分含量為0.63%～0.81%。產品質量指標達到食品級標準。

郭寶華等[20]以蟬蛻、喙尾琵琶甲、中華稻蝗為原料制備甲殼素。80℃下堿脫蛋白，酸脫鈣鹽，蟬蛻甲殼素收率36.23%，灰分含量0.68%，氮含量5.95%；喙尾琵琶甲甲殼素收率22.56%，灰分含量0.15%，氮含量5.54%；中華稻蝗甲殼素收率9.72%，灰分含量0.28%，氮含量5.79%。結果表明：以體壁角質化程度較高的蟬蛻和喙尾琵琶甲為原料提取甲殼素得率高，而以體壁角質化程度較低的中華稻蝗為原料提取甲殼素得率較低。因此在選擇原料時，應盡量選擇體壁角質化程度較高的昆蟲。

利用昆蟲來制備甲殼素和殼聚糖雖然報道較少，但很有開發價值。首先，昆蟲種類多，許多昆蟲都可以用作原料。全世界的昆蟲大約有1 000萬種，約占地球所有生物物種的一半，已定名的昆蟲種類有100萬種。其次，昆蟲繁殖較快，易于實現人工養殖，不受季節、地域和資源的限制。最后，昆蟲體壁中的甲殼素含量可達20%～60%，且昆蟲體壁蛋白質含量較高，無機鹽含量較低，可先用NaOH脫除蛋白質，再用HCl脫除無機鹽，以節約鹽酸的用量。這有利于制備灰分含量低的甲殼素，還可得到蛋白質資源。

3 真菌中的甲殼素

從20世紀80年代后期，日本和美國先后開始研究用微生物發酵的方法生產殼聚糖。C.C.LIN等[21]早在1970年就以Apodachlyasp.為研究對象觀察了細胞壁的組成，用物理化學分離方法從中提取了甲殼素，經過X-Ray衍射分析，與甲殼動物甲殼素相比較差別不大。

用絲狀真菌生產甲殼素/殼聚糖有很多優點：原料來源豐富，不受季節、地點及資源的限制，可大規模生產；制備工藝簡單，甲殼素和殼聚糖相互緊密交織存在于真菌的細胞壁中，只需以蝦蟹殼中用酸堿法提取甲殼素的方法為基礎，作一些改進。首先用稀堿除去菌絲表面的蛋白質等物質，將含有甲殼素和殼聚糖的細胞壁暴露出來，再用酸浸和堿沉淀即可得到殼聚糖，最后存在于細胞壁中的甲殼質經過濃堿脫乙?；兂蓺ぞ厶?，用酸浸和堿沉淀可得殼聚糖。

3.1 不同的培養基會影響菌體生長量和甲殼素的產量

賀淹才等[22]研究了黑曲霉在不同培養基中的菌體生長量，結果表明，黑曲霉在查氏、沙氏培養液中的培養量相差不大，菌體生長速度差不多，而YEPD培養液中菌體生長速度是前兩者的20倍，其培養量也最大。他們依據電解法將幾丁質和蛋白質分離，甲殼素提取的得率占干菌重量的20.6%。

王傳芬等[23]也對用黑曲霉發酵法生產殼聚糖的培養基及工藝條件進行了研究。確定了其最佳培養基和最佳發酵條件，在此條件下殼聚糖得率為11.17%。

3.2 不同的真菌也會影響菌體生長量和甲殼素的產量

王榮等[24]選用總狀毛霉和根霉在相同的培養條件下進行研究，菌絲的生長速度和產量相差不大，但總狀毛霉的殼聚糖產率為17.6%，根霉的殼聚糖產率為12.5%。

陳忻等[25]早在1997年就對不同菌種生產殼聚糖的情況進行了比較，毛霉屬的菌種殼聚糖產率高，質量好，純度高，尤其是雅致放射毛霉在22℃～28℃培養45 h最高產率達1.26×10-2干重/L培養液。雅致放射毛霉是一個很有發展前景的菌種。

P.KOPECEK等[26]研究了3種菌株的甲殼素含量。Basidiobolus ranarum strain CCM 8151菌絲頂點部位甲殼素含量為3.45%，末端為5.20%，Neurospora crassa strain CCM 8041菌絲頂點部位甲殼素含量為2.01%，末端為4.04%，Coprinus sterquilinus strain CCBAS 360頂點部位甲殼素含量為1.34%，末端為5.85%。

3.3 不同的真菌制備甲殼素的方法是不同的

黑曲霉細胞壁中含幾丁質和蛋白質，蛋白質具有可電離的基團，在溶液中能形成帶電荷的陽離子和陰離子，在電場中向一方遷移，故可用電解法[27]制備甲殼素。

米根霉的細胞壁含有天然殼聚糖，可通過發酵法直接進行提取，不需經濃堿脫乙酰步驟，這不僅減少了堿的用量，還可提高企業的經濟效益。

藍色犁頭霉的細胞壁也含有天然殼聚糖，產量占菌絲干重的11.72%。可直接從廢菌體中提取脫乙酰度較高的殼聚糖。其他一些含有天然殼聚糖的菌種有木霉、五通橋毛霉、高大毛霉、華根霉等。

劉樺等[28]將日本根霉發酵培養得到菌絲體。121℃干燥、粉碎后獲得黃褐色的菌絲體粉末。通過茚三酮法測定殼聚糖質量分數為10.22%。

HELENY.LEE等[29]培養Apodaehlya sp.47-17，從菌絲體中分離細胞，提取甲殼素，經化學成分分析，樣品中含葡聚糖39%，甲殼素60%，蛋白質0.1%。

陳雪梅等[30]從檸檬酸發酵廠廢黑曲霉菌絲體中提取甲殼素，不僅可降低殼聚糖的成本，而且為綜合利用發酵廢渣提供了一條新途徑。經性能檢測證明從檸檬酸廠的廢黑曲霉菌絲體中提取得到的是白色顆粒狀晶體的殼聚糖，其得率為7.2%。

4 討論

甲殼素是一種天然高分子化合物，又被稱為動物纖維素，是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖以β（1→4）糖苷鍵連接的乙酰氨基葡萄糖。殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a物，有很好的吸附性、成膜性和通透性、成纖性、吸濕性和保濕性，在工業、紡織業、化妝品行業、醫藥衛生領域及生物醫學材料領域有重要的應用。甲殼素的制備工藝很多，根據不同的原料采用不同的制備方法，目前主要從蝦蟹、昆蟲和真菌中提取。從蝦蟹中制備甲殼素的實例最多，但隨著能源危機和環境污染加重，這種傳統工藝需要改進，不少大專院校和科研單位開發了許多新方法，運用資源化處理法、酶法等新工藝，取得了很大進展。昆蟲作為一種資源走上歷史舞臺，顯示了巨大的應用價值。以昆蟲作為原料制備甲殼素，還可得到豐富的蛋白質、維生素及礦物質和微量元素，是一舉數得的新思路。真菌中甲殼素和殼聚糖分離純化簡單，所得產品性能優良，殼聚糖的脫乙酰度為85%～90%，對金屬離子的吸附能力大，特別適合用于處理含重金屬離子較多的廢水；真菌中的幾丁質復合一些糖類物質，具有特殊的生理功能。

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The Progress of Chitin Extracted from Crustaceans，Insect and Fungi

LIYan-yan，ZHANGShan-shan，RENGuo-dong
（Collegeof Life Sciences，Baoding 071002，Hebei，China）

Chitin is widely found in shrimp shells， the exoskeletons of insects， and fungal cell walls. Thetraditional production method of chitin is the use of shrimp shells as raw material， chitin in shrimp shellsaccounts for 20 % to 30 %， including traditional acid-base chemical method， EDTA technique， and the way ofenzyme solution in recent years. Resource insects and fungi was becoming the focus of research and developmentin recent years. Insects have the characteristics of higher protein content and lower inorganic salt content. Wefrequently make use of acid-base method to extract chitin from insect， but the plan is not as like as shrimpshells. Chitin and chitosan closely intertwined with each other exist in the cell wall in fungi. we make someimprovement according to the acid-base method to extract them.

chitin；chitosan；crustacea；insect；fungi

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.033

2013-12-14

河北省自然科學基金-石藥集團醫藥聯合研究基金（CSPC，E2013201205）；河北省高等學校科學技術研究青年基金項目（Q2012140）

李彥艷（1980—），女（漢），副教授，博士，主要從事生物材料、食品保鮮等研究。