華根霉在釀酒中的研究進展*

竇曉，楊建剛，馬瑩瑩，林秋，林艷，吳赫川

(四川理工學院生物工程學院，四川 自貢，643000)

華根霉(Rhizopus chinonsis)屬于接合菌亞門(Zygomyotina)、接合菌綱(Zygomycetes)、毛霉目(Mucorales)、毛霉科(Mucoaceae)、根霉屬(Rhizopus ehrenberg)［1］，在我國的酒藥和酒曲中廣泛出現。菌落疏松擴散，初期白色，后變褐色。假根不發達，短小，手指狀。孢子囊柄常直立，光滑，淺褐色至黃褐色。孢子囊球形或近似球形，灰黑褐色至黑色，能產生球形、橢圓形或短柱形的厚垣孢子。此菌耐高溫，發育溫度15～45℃，最適宜生長溫度為30℃［2］，由于其耐高溫(45℃能生長)的特性為其擴大工業應用提供了基礎，在傳統和現代發酵工業中有著重要的應用。華根霉多出現在我國的酒藥和酒曲中，可產生淀粉酶、耐酸性木聚糖酶、脂肪酶以及蛋白酶等。淀粉酶可以使底物中的淀粉降解為糊精和一些低分子糖，如葡萄糖、麥芽糖等;脂肪酶可以催化酸和酒精合成酯類物質對酒的香氣成分形成具有重要影響。另外一些書上談到，華根霉還具備一定的酒化能力［2］。而它產生的糖化酶和脂肪酶活性較高在發酵應用中有著重要作用也是近年來研究的熱點。

1 酒曲中華根霉的分離與培養

劉云秀等人對華根霉純種的初步分離做了詳細研究，具體做法是:取酒曲1.0 g于裝有100 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，經兩次平板分離后進行斜面培養，然后采用1株1瓶的方法進行初篩，經鏡檢后再進行第3次平板分離，然后在經過1次復篩和平板分離后，再進行1次復篩(1株3～5瓶)，最后選出較優菌株進行保藏。根據華根霉的生長特性他們設計了5種培養基進行分析比較分別是蔡氏培養基、麥芽汁培養基、豆芽汁培養基、改良的馬鈴薯培養基以及馬鈴薯蔗糖培養基，最后得出培養純種華根霉的最適培養基是改良的馬鈴薯培養基［3］。

2 華根霉在酒類發酵中產酶特性的研究

2.1 對華根霉產淀粉酶方面的研究進展

淀粉酶也稱淀粉水解酶，它是能分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱。包括α-淀粉酶、糖化酶、異淀粉酶、麥芽糖酶等。華根霉產糖化酶活力較強，也可產α-淀粉酶［4］。糖化酶(amyloglucosidase)又稱糖化淀粉酶、淀粉葡萄糖糖苷酶和糖化型淀粉酶。糖化酶在作用于淀粉時，能從淀粉分子的非還原性末端逐一將葡萄糖分子切下并將葡萄糖分子構型從α-型轉變為β-型，它既可水解 α-1，4-糖苷鍵也可以水解 α-1，6-糖苷鍵。因此糖化酶作用于直鏈淀粉或者支鏈淀粉是能將它們完全水解為葡萄糖［5］。華根霉的淀粉酶液化能力很強，在釀酒發酵過程中常為底物液化提供動力。在已知的各類酒曲中常?？梢苑蛛x出性狀優良的華根霉菌株。

劉芳等人為了得到產淀粉酶活力較高的華根霉，對甜酒小曲中分離出的華根霉菌株進行篩選。將篩選出的糖化力和液化力最強的菌株進行紫外線誘變處理，得到了比原菌株酶活力更高的優良菌株，其糖化力和液化力分別比原來菌株高出30%和12.5%，且遺傳特性穩定。此菌株的應用不僅使甜酒的風味更足也縮短了發酵的糖化時間［6］。另外他們還通過正交試驗和單因素實驗對該菌株的產酶條件進行優化研究，得到了此菌株產淀粉酶的最佳條件，使得到的菌株產淀粉酶的活力進一步提高，此時的淀粉酶活力比優化前提高了60.96%［7］。汪彬彬研究了利用Plackett-Benhnken法和Box-Benhnken Design實驗設計法優化華根霉產糖化酶發酵培養基，測定出在通過培養基培養華根霉時影響其產糖化酶活的最顯著的3個因素分別是橄欖油、酪蛋白和麥麩。再對這3個因素進行最陡爬坡實驗篩選出主要因素的中心點，確定出產糖化酶最大值點此時橄欖油0.01%，酪蛋白8.14%，麥麩 4.32%，糖化酶活比優化前提高了81%;在此基礎上又通過響應面法對時間、溫度、接種量、培養基初始PH值等各因素顯著性和交互作用進行分析最后得出最佳培養條件為，時間為71.94，溫度為31.99℃，接種量為11.94%，pH值為6.06此時培養基培養的華根霉產糖化酶的酶活又提高了30%［8］。

李彧娜研究了微孢根霉華根霉變種CICIM F0088的生淀粉酶系。分別對華根霉菌株在固態和液態兩種發酵方式下產生的淀粉酶系進行比較研究。她通過對固態發酵和液態發酵所產生的淀粉酶進行分離純化，結果在固態發酵產物中分離得到3個酶蛋白GAA，GAB和AA，在液態發酵產物中得到2個酶蛋白GAC和GAD。然后對這5種淀粉酶的酶學性質進行分析得出GAA、GAB無論在耐熱性上還是在pH耐受范圍上均優于GAC、GAD。這4種淀粉酶均有一定的生淀粉水解能力，但AA不具備?？紤]到真菌淀粉酶系的復雜性，在分離純化過程中會遺漏一些小產量的淀粉酶，李彧娜根據根酶屬產葡萄糖淀粉酶的氨基酸保守序列和微孢根霉的密碼子偏好性等信息設計出兼并引物，然后再通過PCR和反向PCR技術獲得了該菌株完整的淀粉酶編碼基因gluE。通過對比分析發現gluE是一個新的葡糖糖淀粉酶，在此基礎上運用基因工程手段將gluE的cDNA聯入表達載體，構成重組質粒并成功實現了異源活性表達，發現表達后的重組酶蛋白具有水解生淀粉的能力［9］。總體上來看華根霉在發酵過程中有較好的糖化能力，在此基礎上我們可以通過誘導突變和優化培養條件等方法使其的糖化能力得到進一步加強，為工業生產提供更有力的支撐。

2.2 對華根霉產脂肪酶方面的研究進展

脂肪酶作為一種在異相系統即在油水界面起催化作用的特殊酯鍵水解酶，作用底物主要為天然油和脂肪，水解產物為甘油二酯、甘油單酯、甘油和脂肪酸。脂肪酶在白酒制曲和發酵期間，可以水解原料中所含的脂肪，使原料中的淀粉充分接觸酵母，促進發酵代謝進程;同時產生有機酸和甘油，而有機酸是白酒最好的呈味劑，可以使酒的口味豐富而不單一，增長酒的后味，如酸量適度、比例協調，可使酒出現甜味和回甜感。甘油作為一種多元醇助香劑，可以消除糙辣感，增加白酒的醇和度。更重要的是，脂肪酶同時還可以催化有機酸與大量存在的乙醇生成己酸乙酯、乙酸乙酯等酯類香味物質，從而提高白酒中酯類香味物質的含量，加快白酒中各種酸、醇、酯的反應平衡，縮短貯存老熟時間，調節白酒中各種香味物質的含量和比例，提高白酒品質［10］。

由于脂肪酶在工業上的巨大利用價值，而微生物作為脂肪酶的主要來源，一直是科學界研究的重點。孫舒揚研究優化了華根霉產全細胞脂肪酶在固體培養基上培養的條件，確定了其脂肪酶具有較強的短鏈酯的合成能力且對辛酸乙酯和己酸乙酯的轉化率可高達95%;另外還發現華根霉CCTCCM201021在固態發酵過程中產生的脂肪酶的合成活力和水解活力存在不對應性，并首次采用水解活力和合成活力2種純化標準對華根霉產生的脂肪酶進行純化，并對分離純化的2種同工酶的一些性質進行了研究;發現橄欖油不僅是華根霉生長的碳源也是合成脂肪酶和水解脂肪酶的雙重誘導物［11-12］，而滕云進一步研究了油脂對華根霉產脂肪酶的影響發現其對脂肪酶的水解酶活和合成酶活的影響并不相同，底物中油脂的存在與否對水解酶活影響并不大，但對其合成酶活來說就變得至關重要［13］;顏興和研究了華根霉有機相的合成酶活，通過對7種脂肪酶的合成酶活、水解酶活以及在正庚烷中催化合成己酸乙酯的能力證明了脂肪酶的水解酶活和合成酶活關聯性不強的結論，并且得出合成酶活更能反映脂肪酶的合成能力，合成酶活高的脂肪酶催化脂合成的能力也越強［14］;周藝博研究發現華根霉菌體的聚集有利于其膜結合脂肪酶發酵水平的提高。他在搖瓶水平上研究了發酵液初始量、接種量、擋板條件、裝液量、搖床轉速以及橄欖油的添加量對華根霉菌體形態的的影響并得出塊狀菌體的形成條件，王棟和滕云也在相關方向做了研究［15-17］;朱增亮、王棟等人通過對發酵裝置的改進實現了促進華根霉菌體在7 L發酵罐中的聚集也提高了菌體對橄欖油的利用效率［18-19］。

目前國內外已報道了多個根霉脂肪酶基因序列，其中已報道的Rhizopus stolonifer和Rhizopus oryzae脂肪酶基因的同源性達到80%以上。日本、德國先后用大腸桿菌、釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母成功表達出米根霉脂肪酶基因，但國內外對華根霉脂肪酶分子水平研究較少。王樂樂通過PCR技術首次克隆出了華根霉CCTCCM20021脂肪酶的全基因，其可以編碼一個由389個氨基酸殘基組成的蛋白質，其中26個氨基酸由信號肽編碼，前導序列編碼94個氨基酸，成熟肽編碼269個氨基酸。然后通過基因工程手段構建產脂肪酶的前導肽和成熟肽的重組質粒，并且把重組質粒導入到巴斯德畢赤酵母中進行表達用SDSPAGE分析表達的前肽脂肪酶的最大表達量為0.85 mg/mL，占蛋白分泌總量的68.3%，用PPNP法測得的脂肪酶水解酶活為121.2 U/mL;而成熟肽最大表達量為0.16 mg/mL，占分泌總量的21.6%，脂肪酶水解酶活為4.3 U/mL。進一步研究發現表達的兩種脂肪酶都未進行N末端糖基化修飾，兩種酶的最適反應溫度及pH相近，但底物選擇性和動力學常數相差較大，且它們在異辛烷、正己烷和正庚烷中都表現出良好的穩定性和較高的活力［20］。

2.3 華根霉產其他酶的一些研究進展

華根霉在發酵中主要產淀粉酶和脂肪酶，除此之外研究還發現它還可以產耐酸性木聚糖酶和纖溶酶等。耐酸性木聚糖酶可以水解米粒淀粉層外圍的木聚糖，提高淀粉的利用率，而纖溶酶主要是水解纖維蛋白的酶類。陸健、曹鈺和陳堅等人在國內首次對中國酒曲中分離出來的華根霉產生的耐酸性木聚糖酶進行純化，并和米曲霉和白曲霉產生的耐酸性木聚糖酶進行比較。分析發現米曲霉產生的木聚糖酶在促進米細胞溶解和提高原料米的利用率方面效果更優［21］;遲文鶴和王海寬等對華根霉產纖溶酶的工藝優化和發酵條件等方面進行了研究，優化了產酶條件［22-23］。我們知道，米粒有谷皮、糊粉層、胚乳和胚四部分構成，其中谷皮有果皮和種皮復合而成，其主要成分是纖維素和灰分，而糊粉層和胚里面都富含有蛋白質和脂肪等。米粒的這些部位所含有的物質不僅不利于酒體的釀造，還會影響酒的品質，而根據目前的研究來看，華根霉所產的脂肪酶，木聚糖酶和纖溶酶等可以對這些有害物質的降解產生積極的作用。

3 華根霉對酒類風味物質的貢獻

華根霉在釀酒發酵中的主要作用除了提供糖化力和液化力之外，也為酒類風味物質產生做出了主要貢獻。它可以產生乳酸和脂肪酶，另外一些書籍上也說華根霉可以產酒精。

華根霉可以產乳酸等有機酸，乳酸是釀酒過程中重要的物質，它可以與乙醇結合生成酒類的重要風味物質乳酸乙酯。周小楠以一株野生型的產L-乳酸的華根霉為出發菌，研究了該菌株適宜產酸的條件，并以10keV氮離子對出發菌進行誘變獲得了高產L-乳酸的華根霉突變菌株［24］。

華根霉可以產脂肪酶。脂肪酶不僅可以水解發酵底物中的油脂等，還可以催化分解底物時產生的酸和酒精合成酯類，而酯類是酒中重要的增香物質，對酒類風味的形成至關重要。前面孫舒揚，周藝博等對華根霉產脂肪酶各方面特性進行了深入研究，另外崔如生等人利用華根霉產脂肪酶具有合成己酸乙酯能力的特性制出了一種新的調味酒，用這種調味酒制成的勾兌酒比市面上一般勾兌酒的酒質要好［25-26］。孫舒揚通過實驗確定了華根霉產全細胞脂肪酶具有合成乙酯類風味物質的能力，且對辛酸乙酯和癸酸乙酯的轉化率可高達95%［27］。

4 華根霉在酒曲中的應用

華根霉作為一種在釀酒工業中應用比較廣泛的微生物，在很多酒曲中都能找到它的影子，尤其是在小曲中根霉的作用更為顯著。在大曲中存在的根霉分為黑根霉、米根霉、華根霉、無根根霉幾種。除具有假根的特征外，主要和毛霉、酵母菌共存。在制曲過程中，曲塊表面用肉眼可以觀察到的形狀如同網狀似的菌絲體就是根霉［4］。華根霉菌絲初為白色，隨著大曲發酵的品溫不斷上升和水分的揮發變為灰褐色或黑褐色。如果用顯微鏡觀察可明顯看到其孢子囊;華根霉和曲霉一樣隨著發酵的深入，菌絲插入到大曲的基質中去。但大曲中的根霉主要是米根霉，華根霉較少。小曲中所含的微生物主要是霉菌和酵母菌，而霉菌主要是根霉。其中常見的根霉有河內根霉，米根霉，日本根霉，爪哇根霉，華根霉等。各菌種之間主要是適應性、生長特性、糖化力強弱以及代謝產物上有所差別。目前生產上常用的根霉菌株為河內根霉AS3.866、白曲根霉、米根霉和Q303根霉等［4］。華根霉也在一些研究中發現。曾令琴，葛毅強等人通過對泰國甜酒曲中的優勢真菌進行分離純化培養，鑒定出泰國甜酒曲中的優勢菌株為華根霉和米根霉以及假絲酵母屬的酵母菌［1］。通過進一步研究發現分別用米根霉和華根霉做甜酒曲與Q303根霉相對照表明，這兩種酒曲的液化力均不及Q303，做出的甜酒與Q303相比色澤更好但風味稍差［28］。陳曉蕓對廣東客家釀酒酒曲微生物進行鑒定分離得出興寧地區的酒曲以酒香酵母屬和華根霉為主，河源地區酒曲微生物以米根霉和假絲酵母屬為主并且通過比較發現興寧地區酒曲產酒率和糖度要高于河源地區，興寧地區的酒品質更好［29］。

5 華根霉在新型勾兌酒方面應用的研究

新型勾兌酒是指以優質酒精為基礎酒，經調配而成的各種白酒。新型勾兌酒具有無色透明，香味協調、自然，口味干凈，具有特定的風格等特點。相對于釀造酒來說勾兌酒自身具備很多優點，目前在市場上占有很大的份額。例如，節約糧食，增香原材料豐富，含高級脂肪酸脂少，工藝簡單，適應市場經濟變化等。另外隨著各種新香料物質的發現和新勾兌技術的不斷創新，使得勾兌酒很有可能成為未來白酒的主體類型。由于種種原因，我國的勾兌酒目前存在2個突出問題:一是雜質含量高，二是香味成分不純。這是阻礙勾兌酒發展的2個突出問題。崔如生和徐巖為解決市場上勾兌酒存在浮香突出，質量不穩定等問題，研究出利用R92華根霉生物酯化技術生產香料物質制成調味酒來代替化工合成香料的方法。他們在研究時發現R92華根霉的己酸乙酯合成能力特別強，單純的利用己酸和乙醇作原料中試出來的結果表明己酸乙酯含量很高，但乳酸乙酯和其它微量物質含量偏低，造成酯化液口感單一，己酸味突出。然后他們在生產中又添加了黃水，酒頭和酒糟等物質，豐富了酯化液中其它微量物質的含量。結果表明，通過這種方式做出來的酯化液含有大量的酸脂等微量物質，用此做調味酒生產的46%Vol洋河試驗酒比市場上的銷售的中檔酒在微量成分的數量和含量上都要高，并且品嘗等級分也高于市售中檔酒，成功解決了市售勾兌酒的浮香問題，找到了改善勾兌酒質量的新方法［25-26］。

6 結語

華根霉在制曲和釀酒方面都發揮著作用，它所產的糖化酶活性很強，是釀造工業中常用的糖化菌;能產生酒精、脂肪酶類、乳酸等，常可以增加釀造酒的風味。華根霉的脂肪酶在酒類發酵中合成己酸乙酯、乳酸乙酯等乙酯類香味物質的能力較強，但如果單純用華根霉做純種曲釀造出的酒口味較單一，還需借助其它菌或者添加其他風味物質才能克服自身的不足。另外，對于華根霉在釀酒發酵中的單獨作用研究的還相對較少，在靈活應用自身特性方面也還有許多需要進一步探究的地方:

(1)通過現代生物技術在DNA分子水平上不斷開發和利用華根霉在釀酒中的優良特性，發揮其更大的作用將需要更多的研究工作。

(2)結合華根霉菌體自身的生理特性和產酶特性來看，在固態發酵中，更適宜其菌體的生長和酶活的提高。因此在研究酒類的固態發酵時，華根霉具有更多的利用價值。

(3)利用華根霉產脂肪酶具有高活性的產乙酯類物質的能力結合現代勾兌技術和釀酒工藝的不斷進步，華根霉可在研制新型勾兌酒方面發揮更大的作用。

(4)在深入研究華根霉和其他菌株特性的基礎上，利用它們的互利關系，取長補短，發揮各自的優勢進行有規律的混合發酵，生產出成本更低，質量更優異的產品將會具有很大的市場空間。

(5)由于華根霉產生的淀粉酶具有水解生淀粉的能力，可以考慮利用華根霉進行生料發酵，這將對降低企業的生產成本很有幫助。

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