大鼠原發性腦干損傷后S100B和GFAP的表達變化

吳雨虹，王慧君，王欣

（1.南方醫科大學法醫學系，廣東廣州510515；2.廣州市公安局刑警支隊技術所法醫檢驗科，廣東廣州510030）

腦損傷后神經膠質細胞，尤其是星形膠質細胞常出現反應性膠質增生，這是中樞神經損傷及退行性病變引起的神經組織發生改變的常見現象。S100B蛋白和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillory acidic protein，GFAP）均為神經膠質細胞的標記蛋白，故研究二者在損傷后不同時段的表達變化，有助于了解損傷后膠質細胞的修復情況及推斷損傷時間。本實驗采用機械性打擊致腦干損傷動物模型，應用免疫組織化學法，結合計算機圖像分析技術，檢測大鼠腦干損傷后不同時段腦干組織中S100B、GFAP的表達情況，探討其在原發性腦干損傷中可能的作用機理及損傷時間的變化規律。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

自制打擊裝置，Nikon-ECL IPSE 801光學顯微鏡（日本尼康公司），即用型通用SP免疫組織化學試劑盒、兔抗GFAP多克隆抗體、DAB試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司），大鼠抗S100B多克隆抗體（美國SANTA公司），其余試劑均為國產分析純。

1.2 動物模型建立及分組

SD雄性大鼠48只（購自南方醫科大學實驗動物中心），體質量180~220g。采用隨機分組法，將實驗動物取6只作為對照組，余42只進行建模。自制撞擊裝置，將內徑為1.2 cm的光滑導引管固定在鐵支架上，將一木板固定在鐵支架的底座上，前端設置一垂直的小擋板，導引管與底座的夾角呈45°。采用100g/L水合氯醛按300mg/kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠后，切開頭皮，暴露顱骨，使大鼠俯臥于底座上，調整引導管對準枕骨粗隆，打擊物從導引管的一端自由下滑打擊大鼠枕部，每只大鼠只打擊1次，造成腦干損傷。

腦干損傷模型大鼠在建模后30min內死亡6只，記為傷后30min組，傷后存活者隨機分為6組，每組6只，分別于傷后2、6、12、24、48、72h斷頭處死；對照組大鼠直接斷頭處死。

1.3 取材及染色

大鼠斷頭處死后，立即取腦干組織，放置于4%多聚甲醛固定24h。將腦干沿正中線切開，以切面為包埋面常規脫水，石蠟包埋制成蠟塊，組織經連續切片，厚度為3μm，分別進行常規HE染色及Gless嗜銀染色，并行SP法免疫組織化學染色。

1.4 圖像分析及統計學處理

應用HMIAS-2000W高清晰度彩色醫學圖文分析管理系統（武漢千屏影像技術有限責任公司），在400倍顯微鏡下，隨機選取5個視野，對免疫組化陽性細胞進行檢測，測定陽性細胞的平均灰度值。數據以±s表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較用LSD法。檢驗水準α=0.01。

2 結果

2.1 實驗動物臨床觀察

實驗大鼠受打擊后，均立即出現昏迷、角膜反射消失、抽搐、呼吸急促、心搏加快等體征。傷后30min組的大鼠約在損傷后30s出現不規則的呼吸和心搏，數分鐘后出現心律不齊且搏動減弱，呼吸變慢變深，20~30 min心搏停止。傷后存活的大鼠10~15 min后呼吸和心搏基本恢復正常，約1 h后逐步蘇醒，生命體征平穩，未出現再次昏迷。

2.2 肉眼及HE染色觀察

所有腦干損傷大鼠均可見蛛網膜下腔明顯出血，腦干組織水腫，腦干內見散在的點片狀或橢圓形小片狀出血，傷后30min組出血部位較為廣泛，傷后存活者，出血部位相對較少。

2.3 Gless嗜銀染色觀察

對照組大鼠腦干組織軸索排列規整，走行一致，軸索間隙均一。傷后30min組大鼠彌漫性軸索腫脹、斷裂、扭曲呈蚯蚓狀，軸索末端膨大、間隙增寬。傷后2、6 h在腦干見到上述軸索損傷變化更加明顯，以軸索斷裂、腫脹及扭曲為主。傷后12 h可觀察到軸索斷裂后軸漿流出到腦組織局部所形成的軸索收縮球（圖1），傷后24h軸索收縮球數量增多，體積增大，傷后48、72h軸索腫脹情況有所好轉。

圖1 腦干損傷后12h軸索收縮球形成Gless×400

2.4 SP免疫組織化學染色觀察

2.4.1 S100B的表達

對照組可見S100B陽性細胞染色均勻分布在星形膠質細胞胞體及突起中（圖2A）。傷后30min，星形膠質細胞結構破壞，突起消失，S100B從星形膠質細胞中釋放，表達增加（圖2B，表1，P＜0.01）。之后隨著時間的延長腦干組織中S100B陽性表達逐步升高，并于24h達到高峰（圖2C，表1，P＜0.01）。傷后48h，S100B陽性表達有所下降，但仍高于對照組（P＜0.01），此時可見少數細胞出現單一細長突起。72h基本降至正常水平，細胞體積進一步增大并可見胞核（圖2D，表1，P＜0.01）。

2.4.2 GFAP的表達

對照組GFAP分布在星形膠質細胞的胞質及突起中，胞體較小，突起纖細。傷后30min，GFAP表達增加（P＜0.01，表1），有的細胞形態變得不規則（圖3A）；傷后2h，GFAP表達進一步增強（P＜0.01，表1），突起染色加深（圖3B），之后隨時間的延長逐步上升，48h達到高峰（P＜0.01，表1），胞質染色加深，突起增多，形態不規則（圖3C）；72 h表達下降但仍高于對照組（圖3D，表1，P＜0.01）。

圖2 腦干組織中S100B陽性表達SP×400

圖3 腦干組織中GFAP陽性表達SP×400

表1 大鼠腦干損傷后S100B、GFAP陽性細胞平均灰度值（n=6，±s）

表1 大鼠腦干損傷后S100B、GFAP陽性細胞平均灰度值（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與相鄰上組比較，P＜0.01

組別對照傷后30min傷后2h傷后6h傷后12h傷后24h傷后48h傷后72h S100B 80.774±0.893 86.158±0.7931）2）89.858±0.9371）2）92.198±0.2691）2）94.006±0.6631）2）98.518±0.7761）2）87.954±1.1871）2）81.114±1.0092）GFAP 31.508±0.465 35.938±0.4011）2）37.838±0.5441）2）39.926±0.6841）2）42.530±0.6531）2）44.826±0.4641）2）47.888±0.5471）2）45.922±0.2681）2）

3 討論

星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多、最重要的支持細胞，在中樞神經系統的多種正常生理活動以及神經組織的修復與再生、神經免疫、多種神經疾病的病理機制中都起著十分重要的作用。S100B是一類分子量較小的EF手型鈣離子結合蛋白，具有廣泛的生物學活性，主要由中樞神經系統中星形膠質細胞、少突膠質細胞及周圍神經系統的雪旺細胞分泌，是星形膠質細胞激活的標志之一，可使神經元及膠質細胞內鈣離子濃度增加[1]，而Kligman等[2]報道了在腦皮質神經元培養中，腦S100B蛋白的二硫化物能刺激神經生長，推測S100B蛋白可能通過神經膠質細胞分泌后通過類似旁分泌的作用[3]，刺激神經生長。在損傷反應中S100B表達明顯增加，且與損傷程度和時間有一定關系[4-6]。GFAP是一種中間絲細胞骨架蛋白，在中樞神經系統中特異性地由星形膠質細胞表達，被認為是星形膠質細胞及由其發生的腫瘤的特異性標志物[7]。星形膠質細胞反應的標志是細胞數增加、細胞體肥大、分支增多，GFAP表達增強。因此星形膠質細胞的增殖程度和腦干損傷后腦組織的病變程度可用GFAP的表達值來評價。

本研究采用機械性撞擊法[8]，在保證同等打擊力度和作用時間的前提下，使外來機械力直接作用于顱骨，并能準確打擊大鼠的枕骨粗隆，使腦干受到損傷。HE染色可見腦干組織內有點片狀或橢圓形小片狀出血，并有蛛網膜下腔出血；Gless嗜銀染色發現大鼠彌漫性分布的軸索腫脹、斷裂、扭曲、末端膨大，軸索間隙增寬并收縮球的形成，表明所建立的原發性腦干損傷動物模型科學、可信。

本研究發現，在腦干損傷后30 min內，S100B與GFAP表達即開始增加，此時的增加可推斷為星形膠質細胞的反應性肥大而非增生，同時由于星形膠質細胞結構的受損，S100B與GFAP從細胞中漏出導致二者水平的上升。而反應性星形膠質細胞增生和活化產生大量的S100B本身也促進星形膠質細胞的肥大和增殖，又提高了GFAP的水平，從而形成正反饋放大效應。本實驗證明隨著傷后時間的延續，S100B與GFAP水平不斷升高，24 h和48 h分別為S100B與GFAP水平的最高峰，之后的表達有所下降，到72 h二者水平下降，且S100B與對照組差異無統計學意義。可推測隨著時間的進展，損傷反應不斷增強，24~48h是膠質細胞損傷反應的頂峰，之后損傷反應減弱、膠質細胞自我修復、再生不斷增強，S100B與GFAP表達量減少，直至修復完成。

有研究[9]證實，腦外傷后大量星形膠質細胞瘢痕的形成是新生的星形膠質細胞而非已經存在活化的細胞或遷移細胞所形成。本研究發現腦損傷后S100B、GFAP陽性表達的變化特征，說明星形膠質細胞在不斷被激活新生，這不僅有利于膠質瘢痕的形成，也有利于神經元的修復和功能的恢復。同時，由實驗結果可知，在腦干損傷后S100B與GFAP的表達隨時間呈現一定的變化規律，如果將兩項指標聯合，綜合分析，可以為損傷時間的推斷提供一定的幫助。

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