基于重組蛋白質的水凝膠

孔　娜，高曉曄，李宏斌

(加拿大不列顛哥倫比亞大學化學系，溫哥華加拿大V6T1Z1)

生物組織在實現其功能的過程中依賴其自身特有的理化性質，因此在生物學和藥學等領域，設計制備能夠模擬這些生物性質的功能材料受到了科學界的普遍重視。例如，某些肌肉組織具有特殊的力學性能，其在較低的拉力下顯得柔軟而富有彈性，而當壓力增大時則變得堅硬。這種特有的對作用力的響應性能夠降低受到較強外力時肌肉拉傷的風險。盡管目前在生物材料等領域，研究人員已經能夠設計出模擬某些軟組織的材料，但目前對于能夠實現此類復雜響應性的材料的研發仍是一個難題。因此，由生物分子構成的材料就體現出獨特的難以取代的優勢。

一個代表性的例子就是水凝膠，這是一類具有三維網狀結構的交聯體系，能夠吸收和儲存大量水溶液。構成水凝膠的材料多種多樣，天然或者合成的親水性材料經過適當的交聯即可得到網絡結構的水凝膠。根據交聯方式的不同，水凝膠可以被分為兩大類:物理凝膠或化學凝膠。化學凝膠是指通過共價鍵交聯的凝膠，而物理凝膠是通過物理作用，例如氫鍵、電荷或疏水作用實現交聯的凝膠。不同交聯方式得到的水凝膠在理化性質等方面具有明顯的差異，因此在應用前景上可以滿足不同方面的要求。

組成水凝膠的材料可以分為天然材料和合成材料兩大類。天然材料包括膠原、纖維蛋白等蛋白質以及海藻酸、瓊脂糖等多糖。合成類材料大多是通過聚合反應得到的高分子材料，典型代表是得到廣泛應用的聚丙烯酰胺水凝膠。作為對這兩類材料的補充，通過基因工程方式設計合成的蛋白類材料在近些年得到迅速的發展。通過設計特定蛋白序列對應的DNA序列，并將該DNA導入宿主細胞如大腸桿菌進行表達，即可得到目標蛋白質構筑基元。目前有報道用于水凝膠合成的人工蛋白質包括亮氨酸拉鏈 (Leucine Zipper)、類彈性蛋白 (Elastin-like Protein，ELP)以及多模塊串聯蛋白(tandem modular proteins)。這類人工合成的重組蛋白質在組織工程、藥物載體、生物探針及傳感器等方面得到越來越深入的研究，這主要得益于兩項與蛋白相關的科研新進展，其一是基于復雜蛋白質的結構和功能，科研人員能夠設計多功能的重組蛋白，其二則是分子生物技術的發展使研究者能夠通過控制重組DNA技術最終得到相對分子質量可控、分布均一的目標蛋白質［1］。由于篇幅的限制，我們在這篇簡要的綜述中主要集中討論在重組蛋白質水凝膠的構筑與功能方面的近期發展，而以多肽和天然蛋白質為構筑基元的水凝膠則不在本研究討論的范圍，有興趣的讀者可以參考已發表的綜述。

相比于天然及合成材料構成的水凝膠，重組蛋白質水凝膠具有幾方面的優勢。眾所周知，天然材料普遍具有良好的生物相容性，因此在生物領域得到了廣泛應用［2］。但同時天然材料也存在諸如提純困難、產率低、易失活或難降解等問題，而且不同批次及不同來源的材料往往難以保證性質的一致性，導致天然材料在某些對一致性要求較高的領域的應用前景受到了限制［3］。對于合成材料而言，其組成和性質的調控相對較容易，而且可以對材料的特定性質進行針對性的設計，但合成材料的產物均一度難以精確控制，同時合成材料往往官能團單一，需要進一步官能化來實現某些功能［4］。

通過基因和蛋白工程得到的重組蛋白質不僅兼具了天然材料的生物相容性和合成材料的可控性，同時還具有某些特殊的理化特性。第一，通過重組DNA技術獲得的重組蛋白其相對分子質量均一，結構明確，重復性好［1］。第二，在重組蛋白的設計過程中可以直接引入具有生物活性的短肽或片段，例如結合細胞的RGD或KNEED片段，而不需要材料合成后的進一步修飾［5］。第三，蛋白質本身的多樣性能夠滿足不同目的對材料性質的要求，比如可降解的蛋白質可以用來作為藥物載體，而具有特殊力學性能的蛋白質則是設計組織工程材料的首選蛋白［6］。

1　物理交聯的水凝膠

物理交聯的水凝膠近些年得到廣泛的發展，其主要原因是在交聯過程中不需要額外添加交聯劑［7］。其中物理交聯的蛋白質凝膠由于既保留了蛋白本身的特性，同時其代謝產物又無副作用，因而得到了越來越多的關注。能夠交聯蛋白質的物理方式有很多種，其中主要的推動力包括生物分子識別和蛋白質相變等。

1.1　卷曲螺旋(Coiled coil)

卷曲螺旋是一類在近些年在水凝膠構筑方面得到廣泛應用的生物分子識別。卷曲螺旋是一類蛋白質超二級結構，構成一種蛋白質折疊的基本模式。它是由兩個或多個螺旋相互結合而形成的超螺旋。其主要的特征是由7個氨基酸殘基所構成的重復結構單元，重復片段被稱為七肽重復區，可以用(abcdefg)n來表示［18-19］［圖 1a)］。在水環境中，七肽重復區中疏水性的氨基酸殘基a、d、e和g在螺旋結構中形成疏水內核，而親水性氨基酸殘基b、c和f則暴露在水環境中。通過疏水作用，兩個蛋白質分子形成二聚體。在七肽重復區中，殘基a和d由于在螺旋中提供疏水環境并形成螺旋間的疏水作用而尤為重要。由于a或d通常為亮氨酸殘基或其他非極性殘基，該結構常稱為為亮氨酸拉鏈(Leucine Zipper)結構。一般e和g為帶電荷的氨基酸殘基，b、c和f則為親水性帶電荷或中性的氨基酸殘基。利用這種自發的分子間的物理作用，科研人員開發了多種具有響應性的可逆水凝膠，這類凝膠能夠響應環境的變化比如pH值、溫度或離子強度等條件的改變。

圖1　a)平行雙鏈卷曲螺旋側面圖和俯視圖，卷曲螺旋由重復的七肽序列abcdefg組成。字母a和a’代表不同螺旋的相似位置。當位置a和d上的氨基酸是亮氨酸時，卷曲螺旋被稱為亮氨酸拉鏈結構域(leucine zipper domains)。采自文獻［87］。b)基于卷曲螺旋的蛋白質水凝膠的形成示意圖。藍色的螺旋代表亮氨酸拉鏈結構域，綠線代表親水的間隔基團。水凝膠的形成是由亮氨酸拉鏈結構域的自交聯所驅動的。通過調控卷曲螺旋的聚集，水凝膠的凝膠-溶膠轉變可以通過環境刺激來實現。采自文獻［88］。c)基于卷曲螺旋的雙組分水凝膠。CCE和CCK是2個互補的亮氨酸拉鏈序列(綠色和藍色)。2個串聯的模塊化多聚蛋白序列用來形成水凝膠，其中1個包含3個CCK(三官能，藍色)，另一個包含2個CCE(雙官能，綠色)。紅色的橢圓代表間隔域GB1。混合蛋白溶液使CCK和CCE相互結合成卷曲螺旋，最終交聯導致凝膠形成。采自文獻［13］。

Tirrell等在這一領域開展了開拓性的工作［8］。他們報道了一種基于卷曲螺旋的蛋白質物理凝膠。他們設計了一種三嵌段蛋白，其縮寫為AC10A，其中A代表亮氨酸拉鏈結構域，C10則代表一段親水的無規卷曲的多肽嵌段［(AG)3PEG］10。該三嵌段蛋白能夠通過卷曲螺旋形成可逆的蛋白質自組裝水凝膠［圖1b)］，但意料之外的是水凝膠在溶液中的降解速度非常快。這種現象是由多方面原因造成的，包括多嵌段蛋白形成了分子內的卷曲螺旋結構、亮氨酸拉鏈較低的結合能力、較快的結合周期等［9］。針對這些問題，科研人員采取了一系列的措施來降低水凝膠的降解速度。例如，可以通過在每個亮氨酸拉鏈的一端加入1個半胱氨酸殘基的方式提高亮氨酸拉鏈之間的相互作用，因為在亮氨酸拉鏈形成二聚體時兩個半胱氨酸殘基的巰基能夠形成二硫鍵，進而提高二聚體的穩定性，同時保留了物理凝膠的可逆性［10］。還有一種方法是采用另一種相似的卷曲螺旋蛋白結構域P代替亮氨酸拉鏈A作為三嵌段蛋白的組成部分PC10A［11］，其中卷曲螺旋蛋白結構域P傾向于和另外分子中的P相作用，而不會和A作用形成卷曲螺旋。其結果是杜絕了分子內卷曲螺旋的形成。和設計相符，這種由PC10A蛋白組成的物理凝膠的降解速度比AC10A或PC10P凝膠的降解速度低100倍以上［11］。

我們課題組也開展了這方面的研究并發展了一種新的方法。我們課題組設計并表達了三嵌段蛋白AG8A［12］，其中A 代表亮氨酸拉鏈，G8代表了由8個GB1蛋白域串聯而成的蛋白嵌段，這一嵌段具有良好的穩定性，其剛性也比前文提到的無規卷曲的C10高［13］。剛性更高的中間段顯著增加了分子鏈兩端的距離，降低了兩端的亮氨酸拉鏈域形成分子內結構的幾率。相比于之前報道的AC10A凝膠，AG8A的降解速度提高了10倍。在此基礎上，我們設計了含有兩種多聚蛋白的混合凝膠，兩個組分分別為AG4A 和 CG5CG5C［14］［圖 1c)］。A 和 C 代表了理性設計的兩種亮氨酸拉鏈結構域CCE和CCK，這兩種結構互補［15］，只能形成雜二聚體而不能形成均二聚體，從而進一步降低了形成分子內結構的幾率。這種混合凝膠的降解速度比AC10A低30倍，比AG8A低3倍。由于這種凝膠的兩個組分自身不能形成凝膠，因此相比于均一組分的物理凝膠，這種混合凝膠可以制備各自的高濃度溶液之后再進行混合，降低了凝膠的制備難度，同時提高了組成物理凝膠的蛋白質濃度［15］。

經過近10年的發展，亮氨酸拉鏈結構域已經發展成一種應用最廣泛的生物識別的方法來設計和制備蛋白質水凝膠，以及蛋白質-聚合物雜化水凝膠。利用三嵌段蛋白質的模塊特性，特殊的具有環境應激響應的蛋白質序列可以很方便地引入到三嵌段蛋白質，從而制備具有環境應激響應特性的蛋白質水凝膠［8，10-11，16-18］。同時，具有特定生理功能的蛋白質功能結構域也可以方便地引入到蛋白質水凝膠，從而構筑功能性的蛋白質水凝膠。例如，具有細胞黏附功能的多肽序列及完整的蛋白質結構域的引入使蛋白質水凝膠可以作為人工模擬細胞間質來培養不同的細胞，而酶的引入則為構筑具有催化功能的蛋白質水凝膠奠定了可能。而基于這些功能化的蛋白質水凝膠在生物醫學領域的應用的研究也得到了長足的進展。

1.2　蛋白-蛋白/蛋白-多肽相互作用

在Tirrell等的研究工作基礎上，其他研究組也開展了利用生物識別為驅動力的蛋白質水凝膠的構筑的研究。原則上，任何蛋白質-蛋白質/蛋白質-多肽的相互作用都可以作為蛋白質水凝膠構筑的驅動力。利用不同蛋白質-蛋白質相互作用的結合常數不同，可以設計不同交聯體系的組分比例、濃度以及外部條件來調控所得的水凝膠的性能。由于大部分蛋白質相互作用都是可逆而且具有環境響應性，這類物理凝膠常被用來作為負載藥物或細胞的可注射凝膠材料。

Heilshorn研究組報道了基于WW蛋白域和富含脯氨酸多肽相互作用的雙組分水凝膠(MITCH)［19］［圖 2a)］。所謂 WW 結構域得名于其序列內的色氨酸殘基，這個結構域能夠形成反平行的β折疊結構并與富含脯氨酸多肽結合［20］。通過將WW域或富含脯氨酸多肽與無規卷曲的親水片段串聯得到相應的多聚蛋白，之后將兩組分蛋白溶液在生理條件下充分混合即可得到雙組分的物理凝膠。調節蛋白序列可以控制水凝膠的機械性能，而引入細胞結合位點則能夠提高負載細胞的存活率，使該水凝膠能夠成為可注射的負載細胞的載體。

Regan研究組報道了一種離子響應的水凝膠，這種水凝膠通過34個氨基酸殘基的四三肽重復單元(tetratricopeptide repeat)(TPR)和五肽 DESVD之間的相互作用而交聯［21］。Heilshorn研究組則將TPR與其他蛋白相連，同時在四臂聚乙二醇(4-arm PEG)末端引入DESVD五肽，采用相同的交聯方法制備了類似的水凝膠。由于TPR與DESVD之間的相互作用會被較高的環境離子強度干擾，通過這種方法制備的水凝膠能夠響應環境離子強度的變化，在低離子強度的環境中形成凝膠，而凝膠在高離子強度的環境下則會解交聯。

Topp研究組則在交聯中同時利用了蛋白-多肽的相互作用以及卷曲折疊作用［22］［圖2b)］，設計了兩種三嵌段共聚蛋白，一種是將鈣調蛋白片段與亮氨酸拉鏈通過一段親水的蛋白連接，另一種則是通過一段疏水蛋白連接了兩個鈣調蛋白的結合片段，這兩種蛋白溶液直接混合即能得到物理凝膠。這種凝膠的結構、響應性、強度等性能可以通過凝膠組分比例以及外部條件進行調節。

除了采用串聯的嵌段結構共聚蛋白，另一種蛋白設計方法是將具有交聯能力的片段與低聚蛋白結合成融合蛋白，使其能夠提供多個交聯位點，或者自組裝成含有多個交聯位點的納米纖維。Ito研究組首先報道了由重組融合蛋白與低聚多肽組成的物理凝膠［23］。他們將含有PDZ結構域的tax interactive protein-1(TIP-1)融合到三角形的三聚CutA蛋白的3個頂點，將此蛋白溶液與含有PDZ結合蛋白的四臂聚乙二醇溶液混合即可得到物理交聯的水凝膠。受此啟發，結合離子交聯的自組裝納米纖維的相關報道［24］，Yang研究組設計了一種四聚融合蛋白，稱作類泛素-TIP1蛋白 (ULD-TIP1)［25］。該蛋白能夠增強 Nap-GFFYGGGWRESAI自組裝的納米纖維的相互作用從而實現交聯。與其他物理交聯的凝膠類似，這種凝膠同樣能夠通過調節組分濃度和相互作用能力改變凝膠的機械性能［26］。

1.3　彈性蛋白和類彈性蛋白(ELP)

彈性蛋白是一種廣泛存在于生物組織，例如結締組織、肺、血管、皮膚等組織內的蛋白。彈性蛋白能夠在受到外力拉伸后恢復自身結構，為器官提供拉伸強度和彈性［27］。彈性蛋白的前體是彈性蛋白原，由疏水的五氨基酸重復單元纈-脯-甘-X-甘(VPGXG，其中X為疏水性氨基酸)以及含有賴氨酸的富丙氨酸結構域構成［28-30］。當溫度升高至轉變溫度以上時，無規卷曲的彈性蛋白原發生自組裝，同時富丙氨酸域內的賴氨酸發生交聯，形成不可溶的網絡結構，即彈性蛋白。雖然天然彈性蛋白具有優良的機械性能，并廣泛存在于細胞間質中，但由于難以提純等多方面因素的制約，天然彈性蛋白在組織工程等領域僅得到有限的應用。為此，科研人員開發了一系列的類彈性蛋白(ELP)。類彈性蛋白是一類由與彈性蛋白相似的五氨基酸重復單元VPGXG組成的合成蛋白，具有響應外界環境如溫度、pH值、離子強度等變化的能力。當環境溫度較低時蛋白能夠形成穩定溶液，當環境溫度升高至蛋白的轉變溫度以上時，蛋白質發生迅速的親水-疏水轉變，形成沉淀或水凝膠。這一轉變是可逆的，當溫度降低至轉變溫度以下時蛋白又能夠發生疏水-親水轉變而形成蛋白質溶液。蛋白質的轉變溫度受到其一級結構、相對分子質量、濃度、離子強度和pH值等多方面因素的影響。

Urry等通過對PGVG多聚蛋白的研究開啟了對類彈性蛋白材料的合成與研究［30-31］。這類蛋白在25℃以下時處于無規卷曲狀態并具有水溶性［32］。當溫度升高至25℃以上，該蛋白發生迅速的相轉變，形成β螺旋結構，同時排出與蛋白結合的水分子［33］(圖 3)。之后的研究發展了基于VPGXG重復單元的類彈性蛋白，并基于這類蛋白設計了溫度響應的物理凝膠［34］。通過改變重復單元中的第4個殘基X可以調節多聚蛋白的轉變溫度，同時疏水的折疊和組裝轉變也會導致凝膠性能的改變［35］，因此可以通過設計特定的基因序列得到具有特定屬性的水凝膠，包括轉變溫度、機械性能等方面的控制都可以通過調整基因序列而實現［36］。

圖3　在轉換溫度以上，VPGVG多倍體形成的a)β旋轉和b)β-螺旋結構。采自文獻［33］。

Conticello等系統地研究了基于類彈性蛋白的AB雙嵌段或BAB三嵌段共聚蛋白，其中A為親水的 ［VPGVG(IPGVGVPGVG)2］19或 ［VPGEG(IPGAG)4］14類彈性蛋白，B為疏水的［VPAVG(IPAVG)4］16多聚蛋白［17，37］。這類共聚蛋白在高于一定濃度的水溶液中隨溫度升高會可逆地自組裝為納米顆粒或水凝膠，在這一過程中蛋白質從可溶的伸展態轉變為折疊態。

Capello等設計合成了絲蛋白-彈性蛋白-絲蛋白的三嵌段共聚蛋白［38-39］，其中由GAGAGS重復單元組成的類絲蛋白能夠通過氫鍵作用形成β折疊結晶結構從而提高蛋白穩定性，而同時由GVGVP重復單元組成的類彈性蛋白會干擾類絲蛋白的結晶度，提高蛋白的柔性和水溶性。科研人員研究并報道了這種共聚蛋白的溶脹性和負載能力［38-39］。通過基因工程引入帶電荷的氨基酸殘基能夠提高水凝膠的pH值和溫度響應能力［40-41］。

2　化學水凝膠

除了物理交聯的水凝膠，化學交聯是另一種重要的交聯方法。相比物理交聯水凝膠，由于化學交聯是通過共價鍵進行交聯，形成的水凝膠網絡結構往往更加穩定。目前，已有多種交聯方法被用于化學水凝膠的合成。對于蛋白水凝膠，化學反應通常發生在氨基酸殘基的側鏈上。在20種常見氨基酸中，一些氨基酸含有具有反應活性的側鏈基團，可以作為交聯位點形成水凝膠網絡。以下列舉幾種最近發展的交聯方法。

2.1　酪氨酸(tyrosin)交聯

在生物材料的合成中經常利用酪氨酸側鏈上的活性苯酚基團。在重組蛋白交聯中，酪氨酸的交聯可以通過過氧化酶的催化(如，辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)或光化學反應(如釕離子Ru2+引發)等多種方式。

2.1.1在釕離子和過硫酸銨存在下的光化學交聯

在釕離子Ru2+存在下所引發的基于酪氨酸的光化學交聯反應最早是用來研究蛋白質-蛋白質相互作用。反應過程中，在可見光的照射下2價釕離子配合物發生光解，產生的3價釕離子活性金屬配合物會奪走酪氨酸的1個電子并生成酪氨酸自由基，隨后攻擊其他臨近的酪氨酸殘基。在此過程中過硫酸鹽作為電子受體接受光激發后2價釕離子配合物釋放的電子。兩個相鄰的酪氨酰自由基通過共價交聯自發形成二酪氨酸［42］。Elvin等最早認識到這一反應在蛋白質基生物材料構筑領域的價值，并成功地將這一方法發展成一種高效的制備蛋白質水凝膠的化學交聯方法［43］。

利用這一方法所產生的交聯多發生在多酪氨酸蛋白/肽鏈上，且這些酪氨酸需暴露在環境中。Elvin等成功地制備了基于重組節肢彈性蛋白(Resilin)的具有高彈性的橡膠狀彈性水凝膠。節肢彈性蛋白(Resilin)是一種細胞外骨架蛋白，在許多昆蟲的跳躍、飛行以及發聲等方面起著重要的作用，是一種卓越的彈性材料［44］。Elvin等研究人員通過基因工程和克隆技術得到了第一個重組的原節肢彈性蛋白(pro-resilin)。它是一種未交聯的可溶節肢彈性蛋白，由 Elvin等于 2005年報道，被命名為 rec1-resilin［43］。具有無規線團構象的rec1-resilin由18個重復的單元組成，每個單元由15個氨基酸殘基組成，其序列為GGRPSDSYGAPGGGN，每個單元包含1個裸露的酪氨酸殘基。酪氨酸殘基通過釕離子/過硫酸銨催化，在600 W鹵鎢燈下光交聯成二酪氨酸，最終生成彈性高達97%的橡膠狀彈性水凝膠［圖4a)～圖4b)］。與高分子合成橡膠相比，這種材料具有更高的彈性和更長的抗疲勞時間［43］。這一開拓性的工作為這種方法成為一種通用的高效交聯方法奠定了堅實的基礎。目前這一方法已廣泛適用于合成包含1個或多個暴露的酪氨酸的蛋白質生物材料［45-50］。

圖4　a)雙酪氨酸加合物的結構及光交聯反應。b)通過光交聯反應所形成的rec1-resilin水凝膠(左圖:白光下;右圖:紫外光下)。藍色螢光來自于光交聯所形成的雙酪氨酸加合物［44］。圖4a)～圖4b)改編自文獻［43］。c)B1-resilin組成的蛋白水凝膠的網絡示意及照片。下圖:白光下;上圖:紫外光照射下［49］。改編自文獻［49］。

我們小組采用這種行之有效的釕離子引發的光化學交聯反應來設計一種基于GB1-resilin的蛋白質水凝膠［圖 4c)］，并用它模擬肌肉［49］力學性能。球狀蛋白GB1是一種力學穩定的結構域，而隨機螺旋狀的節肢彈性蛋白可提供酪氨酸殘基用于交聯成膠。在人工合成的多蛋白鏈(G-R)4和GRG5RG4R中，GB1(G)模仿肌聯蛋白中折疊的免疫球蛋白結構域，節肢彈性蛋白(R)模仿肌聯蛋白非結構化序列(如肌聯蛋白中的N2B序列)，這兩個結構域是控制肌肉的被動彈性的兩個重要力學元素。在單分子水平上，多蛋白鏈可以模仿肌聯蛋白的結構和力學性能;在高分子材料水平上，水凝膠可以模仿肌聯蛋白調節的肌肉被動彈性性能。也就是說，通過在單分子水平上的精心設計，可以使蛋白膠在宏觀上獲得所需的力學性能。按照這個思路，我們又設計了串聯的多模塊FnIII-resilin構成的多蛋白水凝膠，用來模仿細胞外基質中天然的串聯的模塊化的蛋白質的功能和行為［50］。另一個有趣的研究是類鐵氧還蛋白(FL)與節肢彈性蛋白組成的水凝膠［51］。由于類鐵氧化還原蛋白的水溶性和力學不穩定性，水凝膠吸水溶脹導致類鐵氧化還原蛋白的解折疊和聚集，這些行為與交聯的網絡交織在一起，賦予了這一水凝膠不同尋常的物理和力學性能，如負膨脹率、高伸縮性和韌性等。

2.1.2辣根過氧化酶(HRP)與過氧化氫

除了光交聯，辣根過氧化酶(HRP)與過氧化氫(H2O2)是另一種通過酪氨酰自由基反應產生二酪氨酸形成蛋白質水凝膠的交聯方法［52］。辣根過氧化酶是一種單鏈β型血紅素蛋白，可以催化苯酚或苯胺類衍生物在過氧化氫中的結合［53］。在這一反應中，辣根過氧化酶先結合過氧化氫，形成的絡合物可以氧化羥苯基。HRP是在凝膠交聯中最常用的過氧化酶，主要集中應用于聚合物的水凝膠交聯上。Qin等最近報道了類橡膠的生物材料，他們采用一種提取自果蠅節肢彈性蛋白的1和3外顯子的蛋白，通過辣根過氧化酶調節的交聯反應生成水凝膠［54］。交聯蛋白通過凝膠電泳、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、圓二色譜(CD)和原子力顯微鏡(AFM)等方法進行檢測。交聯在幾分鐘之內完成，且不需要其他方法的輔助。

2.2　通過賴氨酸(lysine)交聯

β-［三(羥甲基)膦基］丙酸(THPP)是合成多肽類生物材料的三官能交聯劑。THPP中的羥甲基與賴氨酸中的伯胺在生理條件下發生曼氏反應。Chilkoti和Heilshorn科研組報道的類彈性蛋白多肽(ELP)可迅速通過賴氨酸與THPP的反應在水溶液中形成水凝膠［77-78］。ELP交聯的水凝膠的力學性能主要是由賴氨酸的濃度調節。據報道，成纖維細胞［55］、軟骨細胞［56］和人胚狀體［57］都可成功嵌入THPP交聯的水凝膠中，表明水凝膠具有很好的細胞相容性。此外，Kiick組報道，類節肢彈性蛋白多肽(RLP)可通過與THPP反應交聯形成水凝膠［58］(圖5a-c)。他們合成的水凝膠具有可調的力學性能、細胞的黏附性能和變形性能。

圖5　a)節肢彈性蛋白多蛋白鏈通過與THPP反應凝膠的示意圖。b)水凝膠的圖像。水凝膠是由賴氨酸殘基與THPP反應交聯而成［58］。c)NIH-3T3細胞在聚苯乙烯細胞培養皿上的熒光顯微鏡照片(左)和在RLP12水凝膠為培養基質上的熒光顯微鏡照片(右)，標尺為100 μm［63］。圖5a)～圖5c)改編自文獻［58］。d)類彈性蛋白多蛋白鏈通過與THPC反應形成凝膠和包埋小鼠胚體的示意圖。水凝膠是由賴氨酸殘基與THPC反應交聯而成。采自文獻［59］。

由于化學合成過程過于復雜，盡管THPP是一個功能強大的交聯劑，但目前已停止生產和銷售。作為THPP的一種代替品，Heilshorn等研究了四(羥甲基)氯化鏻(THPC)。THPC是1個四官能團的交聯劑，具有與THPP類似的化學結構，常用于阻燃材料。它可以在水溶液中快速生成，并與伯胺或仲胺發生曼氏反應。實驗證明通過THPC反應交聯形成的ELP水凝膠具有很好的細胞相容性［59］(圖5d)。因此，THPC作為一種廉價的可溶的交聯劑常用于交聯反應中代替THPP。

2.3　通過半胱氨酸殘基交聯

以半胱氨酸殘基為交聯位點的交聯方式主要有兩種。其一是在氧化態下將半胱氨酸殘基側鏈的巰基氧化為二硫鍵實現分子間的交聯。有報道將ELP與含半胱氨酸殘基的多聚蛋白連接之后所得的蛋白質能夠在溫和條件下通過巰基被氧化成二硫鍵的方式形成可逆的水凝膠［60］。另一種方式是通過“點擊”反應中的巰基-烯反應實現交聯，將半胱氨酸側鏈的巰基與含有雙鍵的大分子交聯成水凝膠。這是一種常用的蛋白質-聚合物共混水凝膠的合成方式［61-63］。在早期的研究中，Hubbell研究組以端烯基的大分子聚乙二醇為交聯劑交聯含半胱氨酸殘基的重組蛋白得到了蛋白質-聚合物雜化水凝膠［64-65］。Murphy研究組則通過將鈣調蛋白(CaM)上的2個氨基酸殘基突變為半胱氨酸殘基，之后與雙端烯基的聚乙二醇反應并紫外照射的方式制得水凝膠［66］。CaM在有無配體的狀態下具有兩種不同的構象，因此配體的存在與否會直接改變水凝膠中CaM的構象，進而改變水凝膠的性質［67］。Kiick研究組之后報道了一種基于類節肢彈性蛋白(resilin-like protein，RLP)的通過巰基-烯反應得到的水凝膠［68］。通過巰基-烯的反應，含有半胱氨酸殘基的大分子RLP被端烯基的四臂聚乙二醇交聯得到彈性水凝膠，并通過對人成纖維細胞的培養實驗證明了水凝膠具有良好的生物相容性。

雖然巰基-烯反應具有很多優勢并被廣泛研究，但由于天然蛋白中基本不存在雙鍵基團，因此這種方法很少被用來制備純蛋白基凝膠，而如上文所述常被用來制備雜化凝膠。

2.4　通過其他氨基酸殘基的交聯方式

蛋白/蛋白或蛋白/多肽的物理作用的熱力學和力學穩定性普遍較低［69］，但最近科研人員發現并研究了一個具有極高穩定性的蛋白［70］。這種被稱作類免疫球蛋白膠原附著域2(CnaB2)的蛋白，通過1個分子內的酰胺鍵為蛋白提供了極為穩定的結構。研究人員進一步將該蛋白一分為二，一部分為含有13個氨基酸殘基的多肽(Spytag)，另一部分為138氨基酸殘基的蛋白質片段(Spycatcher)，發現兩部分能夠自發地組成一個完整的結構域，其中Spytag中的天冬氨酸-117與Spycatcher內的賴氨酸-31能夠形成分子間的酰胺鍵［71］［圖6a)和圖6b)］。這個共價鍵的形成只需幾分鐘，而且反應活性很高，因此Spycatcher和Spytag之間的特異性反應為設計蛋白凝膠提供了可行性。最近，Tirrell組就報道了一組基于該反應的重組蛋白凝膠體系。他們設計并表達了多嵌段的Spytag-ELP多聚蛋白(AAA)和Spycatcher-ELP多聚蛋白(BB)，并將兩種蛋白的溶液混合得到了化學交聯的水凝膠［72］［圖6c)］。引入能結合細胞的基團的水凝膠具有良好的細胞相容性，能夠作為細胞載體使用［圖6d)］。到目前為止，Spycatcher-Spytag反應體系是唯一的，還沒有研究人員報道類似的形成共價鍵的蛋白-蛋白或蛋白-多肽反應，或許將來能夠發現更多的相似體系。

圖6　a)賴氨酸與天冬氨酸側鏈之間形成異構肽鍵。b)SpyTag和SpyCatcher的示意圖。活性殘基標為紅色［72］。c)通過混合含3個SpyTag的蛋白鏈(AAA)和含2個SpyCatcher的蛋白鏈(BB)，共價交聯產生的水凝膠示意圖。d)包埋在mCherry-Spy水凝膠中的3T3成纖細胞的熒光共聚焦顯微鏡圖像。通道1是mCherry的熒光圖像，細胞所在的位置為黑色陰影區域;通道2顯示的是2個鋪展的成纖細胞(綠色);通道1和通道2是2個通道的疊加。標尺為10 μm。改編自文獻［72］。

3　重組蛋白水動態水凝膠

過去，水凝膠只被當成“白板”，需后期在其表面修飾添加所需功能基團。這樣的水凝膠通常具有固定的結構與性能。盡管這樣的水凝膠能模擬生物體系某一特定的方面，但還不能模擬生物體系高度動態的特性。為更好地模擬生物體系的動態特性，發展動態水凝膠體系是生物材料領域一個重要的研究課題，它的發展有可能為模擬生物結構和仿生組織工程學開拓新的道路。

目前，動態水凝膠分為兩大類:動態整體結構降解水凝膠和動態性能水凝膠。顧名思義，動態整體結構降解水凝膠的整體結構可以降解，發生由凝膠態到液態的相轉變(gel-sol transition)。相轉變可通過破壞水凝膠的組成蛋白鏈或通過外在刺激破壞蛋白鏈之間的交聯點，如通過改變溫度［73］、酸堿性［8］、離子濃度［22］等實現［圖 7a)］。光解水凝膠是其中典型的例子，當光感基團合成于水凝膠鏈上時，光能夠引發這些基團間的反應斷裂，最終導致整個水凝膠的降解。在蛋白水凝膠中，物理交聯的水凝膠通常具有整體結構降解的性質，因為物理交聯的水凝膠是通過氨基酸間非共價相互作用交聯，系統中任何改變一旦足夠強大到可以減弱或抑制這些相互作用時，就會導致水凝膠的整體降解。有些破壞不是永久性的，當這些刺激元素消除時降解的水凝膠可以恢復到初始態。例如，彈性蛋白(elastin)組成的蛋白水凝膠對酸堿性和溫度都非常敏感［73］，系統的設計水凝膠的組成結構將非常有助于控制其對酸堿性和溫度的敏感強度，從而使其符合在藥物運輸和生物組織模擬等實際應用中的材料要求。

圖7　a)由外部刺激引起的水凝膠整體結構動態降解示意圖。降解過程可以是可逆或不可逆的。b)由外部刺激引起的水凝膠動態性能改變及響應示意圖，改變過程中整體網絡穩定不被破壞，水凝膠不發生降解或相變。在水凝膠網絡活性成分會對外界刺激產生反應，從而影響水凝膠的性質。

第二種動態水凝膠，即動態性能水凝膠，擁有穩定的整體結構，但其特定性能是動態可調控的(圖7b)。許多科研工作著重于這類水凝膠的動態物理性質，尤其是動態體積變化，因為體積變化觀察直接且測量簡單。鈣調蛋白(calmodulin)是一種廣泛共知的蛋白，其在與配體結合時，會發生明顯的構象變化。當它存在于水凝膠的蛋白鏈中時，配體的加入將驅使它由伸展的結構變成收縮的結構，同時導致水凝膠的收縮［57，67］。而且，收縮程度與calmodulin的濃度成正比，當calmodulin數量增多時，文獻表明水凝膠體積可收縮到原來的1/5［66，74］。

體積變化的測量對于動態水凝膠的研究是非常有價值的，但同時還有很多其他重要性質的動態變化也在復雜多變的水凝膠結構中得到關注，力學性質便是其中之一。力學性質可以反應材料的硬度、強度和整體結構。目前，對于動態力學性質的研究是非常有限的，主要因為設計復雜、選擇有限和維持蛋白生物功能的困難等方面。

楊氏模量(E)是用于描述材料力學性能的一個物理量。在材料的彈性形變范圍內，應力(σ)與應變(ε)成正比，其比例系數稱為楊氏模量:

應力-應變的關系可以用橡膠彈性的經典統計理論進行分析:

式(2)中，N是交聯密度;R是氣體常數;T是絕對溫度;υ是在膨脹樣品中橡膠的體積分數;Mc是交聯點間的分子質量;M是分子質量;α是伸展率。

由于N=ρ/Mc(ρ是密度)，而且Mc∝LEC，可推算得出楊氏模量與交聯密度(N)成正比，與交聯點間的有效鏈長(LEC)成反比。

目前，用于動態控制水凝膠力學性質的方法主要有兩種。第一種是控制水凝膠的交聯密度，即用外界刺激控制改變原有水凝膠交聯點的數量，如利用光、氧化還原、金屬離子等。這些改變有些是可逆的有些是不可逆的，交聯點的數量也可能增加或減少。通常來說，通過光感基團產生的改變是不可逆的，相反，通過蛋白間相互作用產生的改變大多是可逆的。通過控制水凝膠的交聯密度，科研人員已經成功地發展了制備動態聚合物水凝膠。第二種方法是控制交聯點間的有效鏈長(LEC)。與控制交聯密度的方法不同，交聯點的數量不會被改變，但交聯點間的空間距離將通過外界刺激被增大或減小。這意味著交聯點間的有效鏈長將會延長或縮短。實際上，控制交聯點間的有效鏈長是控制交聯密度的一種特殊形式，盡管它沒有影響交聯點的整體數量，但是密集或松散的空間網鏈仍然與交聯密度有關。我們研究組利用這一原理發展了制備蛋白質動態水凝膠的方法。

在大量的蛋白質家族中，許多已知的球狀蛋白質可以通過與配體結合產生構象變化而引起蛋白質長度的變化，如前面提到的calmodulin，還有adenylate kinase［66，74-75］，它們的構象變化可以引起 蛋白質的氮端和碳端距離改變達2 nm。盡管這樣的構象改變在分子層面已經是比較大的變化，但所引起的蛋白質長度的變化并不足以使水凝膠的力學性能上產生顯著差異。另一種控制蛋白質的構象變化來引起蛋白質長度的變化的方式是通過控制其折疊狀態。相比折疊狀態，蛋白質解折疊可使蛋白質氮端和碳端距離增加到序列全長，例如包含56個氨基酸殘基的蛋白GB1可以通過解折疊增加其有效長度達18 nm。在蛋白質水凝膠中通過蛋白質解折疊構象變化可以達到調控楊氏模量的結果，但化學變性劑誘導的蛋白質解折疊不具有生物相容性，并不能應用到實際的生物應用中［49］。最近，我們研究組通過一種設計的蛋白質折疊開關——互斥蛋白(MEP)來達到控制蛋白質折疊狀態并進而構筑動態蛋白質水凝膠。

互斥蛋白是一種特別的人工設計的插入型融合蛋白［76］，它由一個主體結構域和一個客體結構域組成。客體結構域的N—C末端距離較長，但被嵌入了主體結構域中一個短的表面環結構。由于主體結構域和客體結構域的結構上的不相容，互斥蛋白中的主體結構域和客體結構域只能有一個蛋白結構域能折疊成其天然的三級結構，而另外一個則處于無規線團構象［76］。

我們設計了互斥蛋白GL5-I27，其中GL5作為主域而I27作為客域插入到GL5的第二個表面環上［76］。由于I27有相對較高的熱力學穩定性，互斥蛋白主要存在于GL5(U)-I27(F)構象，表示GL5展開而I27折疊。為進一步控制互斥蛋白的平衡構象，我們將主域的第41和43個氨基酸突變為半胱氨酸，從而形成互斥蛋白GL5CC-I27。我們報道了GL5CC-I27可作為一個對氧化還原敏感的蛋白質折疊開關［77］。在氧化狀態下，Cys41和cys43可以形成二硫鍵，穩定GL5的折疊，迫使GL5CC-I27停留在GL5CC(F)-I27(U)構象。在被還原后，二硫鍵斷開，GL5CC-I27形成GL5CC(U)-I27(F)的構象，主域的解折疊有效增加互斥蛋白的長度達26 nm之多(圖8a)。對GL5CC-I27折疊及構象的深入理解啟發我們將它應用于蛋白基水凝膠的設計。據此，GL5CC-I27開始被用作構建元素生成蛋白凝膠。通過對氧化還原的動態控制，調整GL5CC-I27的構象，使我們能夠充分地控制主域GL5在水凝膠蛋白質網絡中的有效長度，從而改變水凝膠的交聯點間有效長度和力學性能［圖8b)和圖8c)］:在氧化態，該水凝膠的楊氏模量達到60 kPa，而在還原態，楊氏模量則下降到20 kPa［78］。而這些力學性質的動態變化是完全可逆的，這是目前所報道的動態水凝膠的一個特例。這一研究顯示出構筑動態蛋白質水凝膠的前景，而這一方法則代表了一種嶄新的研究思路，為進一步設計動態蛋白質水凝膠奠定了基礎。

4　蛋白質水凝膠在組織工程學和細胞外基質中細胞培養和繁殖的應用

圖8　用于構建動態蛋白水凝膠的互斥蛋白的折疊開關。a)在氧化和還原態下，互斥蛋GL5CC-I27的示意圖。其平衡構象可以通過氧化或還原劑控制。主域GL5CC標為藍綠色，客域I27標為綠色。b)由GL5CC-I27構成的蛋白水凝膠的三維網絡在氧化和還原態的示意圖。c)一個透明圈狀的水凝膠樣品的照片。圖8c)中標尺單位是厘米。采自文獻［78］。

蛋白質水凝膠不僅保留其蛋白組分的生物相容性，也從水凝膠網絡結構中獲得獨特的功能，如力學和結構特性，使它可以模擬許多天然組織。由于擁有這些獨特的性能，許多蛋白水凝膠已被開發用于組織工程學中，作為支持細胞存活的生物材料。組織工程學中水凝膠常被設計來模仿天然細胞外基質的組成［79］。在活體組織中，細胞外基質可以幫助調節細胞在特定的分子信號下的動態，如細胞的增殖、分化和遷移。細胞外基質大分子成分的分布與變化可以導致其組織的不同的組成及功能的多樣性［80］。對于細胞外基質的分析已經確定了各種負責不同功能的活性大分子序列。這些已知的活性序列可以添加在仿生水凝膠的設計中。其中一個最著名的與細胞黏附的蛋白序列是RGD三肽－精氨酸甘氨酸天冬氨酸。RGD是常見的細胞黏附蛋白結構域，廣泛存在于細胞外基質和血液的多種天然蛋白質中(如纖連蛋白fibronectin，玻連蛋白vitronectin，骨橋蛋白 osteopontin，膠原蛋白 collagens)［81］。它可以被超過20種的整合蛋白識別，并促進細胞的黏附、擴散和生長。因此，科學家們已經將RGD加到水凝膠的組成鏈或連接在水凝膠表面，以用于細胞的黏附、擴散和擴增［82］。鑒于不同水凝膠的設計所需，RGD序列可以直接納入或由天然含 RGD 的蛋白質加入水凝膠蛋白鏈［50，72，83］。Tenascin-C是一種多模塊串聯細胞外基質蛋白，在維持細胞與基質的相互結合中起重要作用。Tenascin-C第三纖連蛋白III型結構域(TNfn3)是一種含RGD的結構域。我們的研究結果表明，含TNfn3和節肢彈性蛋白(resilin)的多蛋白鏈可光交聯成楊氏模量約為20 kPa的彈性水凝膠［50］。人肺成纖維細胞可以成功地在TNfn3水凝膠表面擴散和傳播。

除了二維表面細胞培養，許多研究都強調三維細胞嵌入的重要性，這是因為三維培養基質能夠更準確地模擬天然細胞外基質，更重要的是細胞更適應三維的培養環境。用于3D細胞嵌入的材料必須具備許多關鍵的力學性能，如合適的硬度和細胞黏附能力。研究證實，精確地調整這些屬性會影響細胞的行為，包括形態、遷移、分化，與鄰近細胞作用和細胞內信號傳遞［84-85］。如前文所述，由SpyCatcher和SpyTag構成的化學水凝膠可成功地用于三維細胞嵌入［圖6d)］。由于BB蛋白鏈含RGD和MMP-1序列，該spy系統可支持細胞存活、傳播和細胞質重塑［72］。此外，又如之前提及的 MITCH系統，它涉及WW結構域和富含脯氨酸的肽鏈之間的物理相互作用，這一系統也被測試了其對于嵌入多種細胞的能力和黏彈力可控性［19］。最新的結果表明，MITCH系統可以幫助提高在活體實驗中植入干細胞的存留［86］。這一系統中，快速的物理交聯所形成的交聯網絡使得水凝膠在注射時在適當平行力下分解并在作用力停止后實現重組［86］。這些特點使水凝膠成為一種理想的注射細胞的載體。基于不同的物理或化學交聯的設計，重組蛋白水凝膠可成為合適的材料提供所需性質和功能。

5　結論與展望

經過近20年的發展，基于重組蛋白質的水凝膠取得了長足的進展，科研工作者已經制備出了許多具有創新性的蛋白質水凝膠體系以滿足從基本的生物學研究，組織工程到藥物緩釋等不同領域應用的需求。通過蛋白質工程和設計，蛋白質水凝膠的特性可以通過理性設計以達成實際應用所需要的特性，比如機械特性和降解性能。我們預測這一領域將會繼續保持快速的發展，研發的新型的蛋白質水凝膠將會使新的應用變為可能。展望未來，我們認為發展新型的生物相容的物理交聯和化學交聯方法依然是這一領域的重要使命。以基于生物識別為基礎的物理交聯的蛋白質水凝膠為例，科研工作者目前所選用的生物識別的體系僅僅只是生命體系中所存在的生物識別中的冰山之一角。許多在生物體系中普遍存在的生物識別體系尚未被用來構筑蛋白質水凝膠。其中一個例子就是蛋白質片段重構(protein fragment reconstitution)。我們可以預期科研人員將會探索和發展新型高效的生物識別來構筑具有特定的物理化學性質和功能的蛋白質水凝膠，并通過調控生物識別的相互作用的強度來調控水凝膠的性質。而在化學交聯的蛋白質水凝膠方面，類似的挑戰同樣存在，尤其是發展生物相容的化學交聯方法至關重要。降低并消除化學交聯劑的毒性是拓展蛋白質水凝膠在生物醫學領域應用的前提，基于這一考慮，發展 Spycatcher+Spytag一類的化學交聯方法就顯得尤其具有吸引力，我們預測這一方向將成為蛋白質水凝膠領域的一個前沿，將為蛋白質水凝膠在生物醫學和組織工程領域的真正應用奠定堅實的基礎。可以預見，蛋白質水凝膠領域將會有一個更加美好的將來。致謝:

這一研究工作得到了加拿大健康研究院的資助。

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