長鏈烷烴降解菌C6的鑒定及性能研究

呂立君，王光華，李文兵，盧露露，劉念汝，陳 彪

（武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

長鏈烷烴降解菌C6的鑒定及性能研究

呂立君，王光華，李文兵，盧露露，劉念汝，陳 彪

（武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

從含油活性污泥中篩選出一株長鏈烷烴降解菌C6，進(jìn)行了菌種鑒定，考察了該菌對正十六烷及柴油和石蠟的混合物的降解能力，并對由菌株C6產(chǎn)生的生物表面活性劑進(jìn)行了鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該菌為鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）；對液體培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的正十六烷降解48 h后，降解率接近100%，降解動(dòng)力學(xué)曲線的擬合結(jié)果符合Monod模型；對液體培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的柴油和石蠟的混合物降解96 h后，降解率達(dá)93%；菌株C6產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)FTIR分析鑒定為磷脂類表面活性劑，排油圈直徑為60 mm，臨界膠束質(zhì)量濃度約為25 mg/L，可將水的表面張力降至27.09 mN/m。

長鏈烷烴；含油活性污泥；菌種篩選；生理生化鑒定；降解動(dòng)力學(xué)；生物表面活性劑

長鏈烷烴是嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境的有機(jī)污染物之一，由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、疏水性強(qiáng)、常溫常壓下為固體，很難自然降解，易對環(huán)境造成長期的危害。經(jīng)污水廠處理后的石化廢水仍含有大量的長鏈烷烴，作為循環(huán)水使用時(shí)可將長鏈烷烴帶入新一輪的生產(chǎn)中。劉雪琴［1］采用生物活性炭技術(shù)處理武鋼焦化廠二沉池廢水，反應(yīng)后仍有部分長鏈烷烴未被徹底降解。對武鋼焦化廠蒸氨塔原水及引用的中水采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)長鏈烷烴均來自中水。通過針對未降解的長鏈烷烴持續(xù)篩菌，完善復(fù)合菌系，可達(dá)到更好的生化處理效果。由于長鏈烷烴的疏水性，需篩選出一株能產(chǎn)生表面活性劑的菌株，以降低長鏈烷烴與水的表面張力。生物表面活性劑除了具有良好的降低表面張力、乳化、發(fā)泡的特性外，還具有易生物降解、無污染的優(yōu)點(diǎn)［2］。不同的菌株產(chǎn)生不同的生物表面活性劑。根據(jù)親水基的不同，表面活性劑可分為糖脂類，脂肽類，磷脂類，脂肪酸類，結(jié)合多糖、蛋白質(zhì)和脂的聚合物等5類［3］。

本工作從含油活性污泥中篩選出一株能產(chǎn)生表面活性劑的長鏈烷烴降解菌，對其進(jìn)行了菌種鑒定，研究該菌對正十六烷及柴油和石蠟的混合物（簡稱柴蠟混合物）的降解能力，并對由該菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑進(jìn)行鑒定與性能研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料和儀器

正十六烷：色譜純；柴油、石蠟：分析純。含油活性污泥：取自中國石化武漢石油（集團(tuán)）股份有限公司曝氣池。

LB培養(yǎng)基：酵母浸提物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L。pH為6.8～7.2，于121.3 ℃下濕熱滅菌20 min后備用。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：硝酸銨1 g，磷酸氫二鈉1.42 g，磷酸二氫鉀1.36 g，七水硫酸鎂0.432 g，氯化鈣0.006 g，微量元素混合液1 mL，蒸餾水1 L。pH為6.8～7.2，于121.3 ℃下濕熱滅菌20 min后備用。其中，微量元素混合液成分為一水硫酸錳1.69 g/L，六水氯化鈷0.24 g/L，硼酸1.16 g/L，二水鉬酸鈉0.024 g/L，七水硫酸亞鐵2.78 g/L，七水硫酸鋅1.15 g/L，五水硫酸銅0.38 g/L。

在上述培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂，得到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

Agilent 6890型氣相色譜儀：德國安捷倫有限公司；UV-2000型紫外-可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；JK99型全自動(dòng)張力儀：上海忠臣數(shù)字設(shè)備技術(shù)有限公司；Mastercycler gradient VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀：德國Bruker有限公司。

1.2 長鏈烷烴降解菌的篩選及鑒定

向采集到的含油活性污泥中加入一定量的蒸餾水，離心10 min，取適量上清液接種于以正十六烷（質(zhì)量濃度為500 mg/L）為唯一碳源的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速125 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)36 h。取4 mL菌液接種于以正十六烷（質(zhì)量濃度為500 mg/L）為唯一碳源的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速125 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)一段時(shí)間，反復(fù)操作，使正十六烷質(zhì)量濃度從500 mg/L逐步提高至5 000 mg/L。取適量富集培養(yǎng)液，稀釋后均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上。待有明顯菌落出現(xiàn)后，采用平板劃線分離法分離單菌落。

挑取單一菌落接種于正十六烷質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速125 r/min的搖床中振蕩48 h。采用氣相色譜儀檢測剩余正十六烷的質(zhì)量濃度，選出降解率最高的菌株C6。

按照文獻(xiàn)［4］報(bào)道的方法對菌株C6進(jìn)行16S rDNA分子遺傳學(xué)鑒定。

1.3 長鏈烷烴降解菌對正十六烷和柴蠟混合物的降解

將優(yōu)勢菌C6按4%（φ）的接種量接種于正十六烷質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速125 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測定菌體生長曲線和正十六烷質(zhì)量濃度。

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，采用菌株C6降解質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的柴蠟混合物。

1.4 表面活性劑的提取

按照文獻(xiàn)［5］報(bào)道的方法，從接種菌株的正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基中提取表面活性劑并純化。

1.5 分析方法

以菌體培養(yǎng)液在600 nm處的吸光度（OD600）表征培養(yǎng)液中的菌體濃度。

采用氣相色譜儀測定正十六烷的質(zhì)量濃度。色譜條件：進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測器溫度300℃，柱溫150 ℃保持1 min，以10 ℃/min的升溫速率梯度升溫至280 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

采用全自動(dòng)張力儀測定表面張力。

采用紫外分光光度法［6］，在225 nm處測定柴蠟混合物的吸光度，計(jì)算柴蠟混合物的質(zhì)量濃度。

按照文獻(xiàn)［7-8］報(bào)道的方法測定生物表面活性劑的排油活性、乳化性和臨界膠束質(zhì)量濃度。按照文獻(xiàn)［9］報(bào)道的方法對生物表面活性劑進(jìn)行FTIR分析。采用薄層層析法對生物表面活性劑進(jìn)行薄層分離，根據(jù)不同顯色劑的顯色結(jié)果判斷生物表面活性劑的種類［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 長鏈烷烴降解菌的16S rDNA鑒定

通過提取菌株C6的基因組DNA，將篩選出的PCR產(chǎn)物送武漢擎科有限公司測序。測序后獲得總長為1 414 bp的16S rDNA基因片段，該序列在GenBank中的登陸號(hào)為KR072555。

菌株C6的16S rDNA序列與不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）的16S rDNA序列相近，同源性大于98%。因此，初步鑒定菌株C6為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）。

將菌株C6的16S rDNA序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行BLAST相似性分析，對同源性高的11株菌株用Mega軟件以相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株C6與Acinetobacter baumannii IBL-4C6處于同一支。因此，鑒定菌株C6為鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）。

2.2 菌株C6對正十六烷的降解

正十六烷的降解曲線和菌株C6的生長曲線見圖1，正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基的表面張力見圖2。

圖1 正十六烷的降解曲線和菌株C6的生長曲線● 正十六烷質(zhì)量濃度；■ OD600

圖2 正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基的表面張力

由圖1和圖2可見：菌株C6的生長趨勢與正十六烷的降解過程基本同步，表明菌株C6能以正十六烷作為唯一碳源促進(jìn)自身生長，并對正十六烷進(jìn)行降解；降解時(shí)間為0～12 h時(shí)，OD600較低，主要是因?yàn)檎椴蝗苡谒诮到獬跗冢?xì)胞與底物之間的接觸受限，妨礙了底物的代謝速率，導(dǎo)致菌體生長速率緩慢；降解12～36 h時(shí)，OD600迅速增加，正十六烷質(zhì)量濃度逐漸降低，在此階段菌株C6分泌出生物表面活性劑，該表面活性劑對正十六烷具有增溶作用，將正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基的表面張力降至27 mN/m左右；降解36 h后，菌株C6的生長進(jìn)入穩(wěn)定期；降解48 h后，正十六烷基本降解完全，降解率接近100%，菌株C6因缺少碳源而進(jìn)入衰亡期。

2.3 菌株C6降解正十六烷的動(dòng)力學(xué)方程

采用Monod方程建立菌株C6對正十六烷的降解模型［10-11］。Monod方程表明了底物濃度和降解速率的定量關(guān)系，見式（1）。

式中：v和vmax分別為底物生物降解速率和最大底物生物降解速率，mg/（L·h）；K為底物半飽和系數(shù)，mg/L；ρ為底物質(zhì)量濃度，mg/L。

以1/ρ為橫坐標(biāo)，1/v為縱坐標(biāo)，得到1/v～1/ρ的關(guān)系曲線，見圖3。1/v～1/ρ的關(guān)系曲線方程為y=5.35x+0.013 5，相關(guān)系數(shù)為0.998。由圖3求得截距1/vmax=0.013 5，得出vmax=74.1 mg/（L·h）；斜率K/vmax=5.35，可得K=396.3 mg/L。由此可見，得到菌株C6降解正十六烷的動(dòng)力學(xué)方程為v=74.1ρ/（396.3+ρ）。

圖3 1/v～1/ρ的關(guān)系曲線

2.4 菌株C6對柴蠟混合物的降解

柴蠟混合物的降解曲線見圖4。由圖4可見：降解時(shí)間為0～36 h時(shí)，降解速率較快，柴蠟混合物質(zhì)量濃度由1 000 mg/L降至500 mg/L以下，柴蠟混合物中短鏈烷烴基本降解完全；降解時(shí)間為36～96 h時(shí)，降解速率下降，推測可能是由于烷烴碳鏈長度的增加，降解難度增大；經(jīng)過96 h的降解，柴蠟混合物降解率達(dá)93%，比馬秋莎等［12］報(bào)道的柴蠟混合物降解率高6%。表明菌株C6對廢水中長鏈烷烴的降解有很高的應(yīng)用價(jià)值，達(dá)到了篩菌目的。

2.5 生物表面活性劑的性能分析

由正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基中提取到的生物表面活性劑呈淡黃色粉狀，排油圈直徑為60 mm，臨界膠束質(zhì)量濃度約為25 mg/L，可將水的表面張力降至27.09 mN/m。

生物表面活性劑的FTIR譜圖見圖5。由圖5可見，3 442 cm-1處出現(xiàn)了O—H鍵的吸收峰，1 644 cm-1處出現(xiàn)了NH+的吸收峰，1 531 cm-1和1 398 cm-1處出現(xiàn)了C=O鍵的吸收峰，1 107 cm-1處出現(xiàn)了PO—R鍵的吸收峰，667 cm-1處出現(xiàn)了P=S鍵的吸收峰。結(jié)合Robert等［13］的研究結(jié)果和薄層層析法的鑒定結(jié)果，判定菌株C6產(chǎn)生的表面活性劑為磷脂類表面活性劑。

圖4 柴蠟混合物的降解曲線● 柴蠟混合物質(zhì)量濃度；■ 柴蠟混合物降解率

圖5 生物表面活性劑的FTIR譜圖

3 結(jié)論

a）從含油活性污泥中篩選出一株長鏈烷烴高效降解菌C6。經(jīng)鑒定該菌為鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）。

b）菌株C6對液體培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的正十六烷降解48 h后，降解率接近100%，降解動(dòng)力學(xué)符合Monod模型。

c）菌株C6對液體培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的柴蠟混合物降解96 h后，降解率達(dá)93%。說明菌株C6對長鏈烷烴有良好的降解作用。

d）菌株C6產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)鑒定為磷脂類表面活性劑，排油圈直徑為60 mm，臨界膠束質(zhì)量濃度約為25 mg/L，能將水的表面張力降至27.09 mN/m。

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（編輯 王 馨）

Identification and Characteristics of Long-Chain Alkane Degrading Strain C6

Lü Lijun，Wang Guanghua，Li Wenbing，Lu Lulu，Liu Nianru，Chen Biao
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

The long-chain alkane degrading strain C6 from oily activated sludge was identified. Its degradation abilities to n-hexadecane and the mixture of diesel and paraffin were studied，and the bio-surfactant produced by it was characterized. The experimental results show that：Strain C6 is Acinetobacter baumannii；After n-hexadecane with 1 000 mg/L of mass concentration in medium is degraded for 48 h，the degradation rate is nearly 100%，and the degradation kinetic curve meets the Monod model；After the diesel and paraff i n mixture with 1 000 mg/L of mass concentration in medium is degraded for 96 h，the degradation rate is 93%；The bio-surfactant produced by strain C6 is characterized by FTIR and identif i ed as phospholipids with 60 mm of oil spreading size，25 mg/L of critical micelle mass concentration （CMC）and the water surface tension is decreased to 27.09 mN/m by it.

long-chain alkane；oily activated sludge；strain screening；physiological and biochemical identif i cation；degradation kinetics；bio-surfactant

X172

A

1006-1878（2015）05-0487-05

2015 - 05 - 23；

2015 - 06 - 29。

呂立君（1990—），女，湖北省武漢市人，碩士生，電話 15926487793，電郵 927712226@qq.com。