大黃魚(Larimichthys crocea)補體C3和C4基因的分子特征及表達分析*

王海玲　祁鵬志　郭寶英　吳常文

(浙江海洋學院　國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心　舟山　316022)

大黃魚(Larimichthys crocea), 又稱石首魚、黃花魚、紅瓜等, 隸屬于鱸形目、石首魚科、黃魚屬, 為我國傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”(大黃魚、小黃魚、帶魚、烏賊)之一。大黃魚主要分布于南海雷州半島以東至黃海南部西側(cè), 范圍涵蓋南海、東海和黃海南部, 結群生活于亞熱帶近海中下層。大黃魚是我國沿海一種重要的海洋經(jīng)濟魚類養(yǎng)殖品種之一, 也是我國主要的網(wǎng)箱養(yǎng)殖海水魚類(Wanet al, 2009)。近年來, 隨著大黃魚人工養(yǎng)殖技術的不斷完善和成熟, 大黃魚養(yǎng)殖也在水產(chǎn)養(yǎng)殖中產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟和社會效益。但是,也出現(xiàn)了諸如養(yǎng)殖品質(zhì)低、生長衰退、抗病能力弱等問題, 嚴重制約了大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展(Zhenget al, 2006)。對大黃魚先天免疫的研究將會對大黃魚的疾病控制起到重要的作用。近年來, 隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展, 越來越多的大黃魚免疫相關基因被克隆出來(Zhenget al, 2006; Wanet al, 2009; Qianet al, 2013)。隨著許多經(jīng)濟魚類基因組計劃的成功完成, 對基因開展 mRNA水平上的研究也變得越來越重要(Davidsonet al, 2010; Smithet al, 2013;Venkateshet al, 2014)。目前, 本實驗室即國家養(yǎng)殖設施與工程技術中心已經(jīng)聯(lián)合上海交通大學 Bio-X研究中心對大黃魚基因組圖譜成功進行了繪制, 對大黃魚開展基因水平上的研究已刻不容緩。

大黃魚由于其重要的經(jīng)濟價值, 近年來在我國的養(yǎng)殖面積日益增加, 但病害問題嚴重, 其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是養(yǎng)殖大黃魚弧菌病的主要病原之一。因此, 有必要對溶藻弧菌侵染后大黃魚的免疫反應進行研究, 以期為大黃魚的免疫學研究及健康養(yǎng)殖提供一定理論依據(jù)。免疫系統(tǒng)是保護魚體免受病原微生物入侵的防御系統(tǒng)(艾慶輝等, 2007), 也是魚類維持正常生理功能的保障。免疫系統(tǒng)主要由免疫組織及器官、免疫細胞和體液免疫因子組成。魚類是最早同時出現(xiàn)特異性免疫和非特異性免疫的脊椎動物。與哺乳類相比, 其特異性免疫系統(tǒng)不發(fā)達, 因此魚類更多依賴非特異性免疫來抵御病害生物的入侵以及修復感染損傷的機體。而非特異性免疫主要由一些抗氧化酶如超氧化物歧化酶、磷酸酶及補體C3、C4 參與(Lvollet al, 2006; 區(qū)又君等, 2011; Yuet al,2011)。在補體各成分中, 補體第三組分(C3)在血清中含量最高, 是補體系統(tǒng)的核心。 C3是哺乳動物補體系統(tǒng)中最重要的組成部分, 是激活和效應中心, 補體系統(tǒng)的三大激活途徑均匯集于 C3, 然后產(chǎn)生相應的效應。C3也與旁路途徑的激活起始有關, 旁路途徑屬于自發(fā)性激活, 一種稱為C3的“慢速運轉(zhuǎn)”(tick over)機制(Müller-Eberhard, 1988)。C3在功能上不僅依賴的陽性反饋環(huán)路的基礎; 而且 C3裂解片段及其結合蛋白復雜多樣, 在免疫防御、免疫調(diào)控以及免疫病理中發(fā)揮著重要的作用(翟瑞燕等, 2010)。

補體是魚類免疫防御系統(tǒng)的重要組成成分, C3參與形成靶細胞表面攻膜復合物(MAC), 導致靶細胞溶解。C3的存在通常可作為補體系統(tǒng)中旁路激活途徑存在的一個依據(jù)。C3是個包含硫酯的蛋白, 相對于補體系統(tǒng)中的其它組成部分而言, C3沒有非常清晰的結構區(qū)域, 但它的系統(tǒng)發(fā)生可以追溯到原口動物——刺胞動物、節(jié)肢動物和兩側(cè)對稱動物(Fujitoet al, 2010; Buresovaet al, 2011)可以認為C3是補體系統(tǒng)進化過程中最早出現(xiàn)的分子。在哺乳動物中, C3與C4、C5 同源, 這三個分子與血清蛋白酶抑制因子α 2M(α-2-macroglobulin)以及血細胞的 GPI錨定膜蛋白CD109 (Linet al, 2002)同屬于一個家族——硫酯包含蛋白家族。目前, 已經(jīng)在低等的后口動物乃至原口動物中克隆獲得C3的cDNA序列, 部分有了功能上的研究結果(Clowet al, 2004; Zhuet al, 2005)。在按蚊和果蠅中均發(fā)現(xiàn)硫酯包含蛋白 TEP, 據(jù)報道, 這些分子擁有類似于脊椎動物 C3的調(diào)理作用, 它們作為調(diào)理素參與病原菌的清除(Bou Aounet al, 2011;Poveloneset al, 2011)。

1　材料與方法

1.1　材料

一齡大黃魚 5尾, 取自福建沙埕港, 體重約 700g/尾, 活體運輸?shù)綄嶒炇? 取腦、肌肉、肝臟、脾臟、心臟、鰓、腸和胃這 8個組織迅速投入液氮中保護RNA并轉(zhuǎn)移至－80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛∩鲜?個組織的總 RNA并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA, 用于大黃魚補體C3(L.c-C3)和補體C4(L.c-C4)基因的克隆擴增及組織表達譜檢測。

不同胚胎發(fā)育階段的大黃魚, 采自福建省福鼎市沙埕養(yǎng)殖基地, 是在大黃魚卵受精后每1h、3h、7h、12h、17h、24h后采樣, 分別對應大黃魚胚胎發(fā)育的2細胞期、多細胞期、原腸初期、眼泡出現(xiàn)期、尾芽期、初孵仔魚, 并用光學顯微鏡進行確認。

一齡大黃魚(500—700 g/尾)共 36尾, 健康無傷病, 于循環(huán)水族箱中暫養(yǎng)一周以上。飼養(yǎng)期間投喂新鮮小雜魚。分為對照組和誘導組兩組, 每組 18尾。誘導組于腹腔內(nèi)注射溶藻弧菌 200μL(PBS重懸, 細胞數(shù)約為1.0×107個), 對照組注射PBS 200μL。分別于注射后0h、6h、12h、24h、48h和72h采樣, 每組每次隨機挑取 3尾, 解剖取肝臟和脾臟兩個組織,于液氮中速凍后保存于－80°C超低溫冰箱, 用于誘導后不同時間點的表達變化分析。

1.2　L.c-C3和L.c-C4基因克隆及全長cDNA的獲得

大黃魚基因組草圖已經(jīng)由浙江海洋學院國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心聯(lián)合上海交通大學Bio-X研究中心聯(lián)合繪制完成(Wuet al, 2014), 利用該基因組數(shù)據(jù), 作者已得到L.c-C3和L.c-C4基因的全長。

總 RNA提取采用 TRIZOL(美國 Invitrogen公司)試劑, 提取方法參照說明書。瓊脂糖電泳檢測提取效果(圖1), 然后用DNase I酶于37°C消化30 min以去除殘留的DNA。用Poly(T)18和Power Script Transcriptase(Clontech)將消化后的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

圖1　瓊脂糖電泳檢測RNA提取效果Fig.1　RNA examination by agarose gel electrophoresis

1.3　序列分析

采用ORF finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)對L.c-C3和L.c-C4基因cDNA全長序列進行開發(fā)閱讀框(ORF)預測。采用SMART (Simple Modular Architecture Research Tool) (http://smart.gemblheidelberg.de/)和 SignalP 4.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignaIP/)分別進行結構域分析和信號肽分析。利用 CLUSTALW X2軟件進行氨基酸序列的多重比對。采用MEGA 4.0軟件比較不同序列之間的相似度并構建系統(tǒng)發(fā)育樹, 樹形分支置信度通過開展1000次自舉重復得到。

1.4　熒光定量檢測大黃魚 L.c-C3和 L.c-C4基因mRNA的表達特征分析

分別取3條健康大黃魚(腦、肌肉、肝臟、脾臟、心臟、鰓、腸和胃)共 8種不同組織檢測L.c-C3和L.c-C4基因mRNA的組織差異性表達、取不同胚胎發(fā)育階段(2細胞期、多細胞期、原腸初期、眼泡出現(xiàn)期、尾芽期和初孵仔魚)共 6個時期的大黃魚受精卵檢測不同發(fā)育階段中L.c-C3和L.c-C4基因mRNA的差異性表達、取溶藻弧菌侵染的大黃魚(每一取樣時間點的實驗組和對照組魚各 3尾)肝臟和脾臟組織,分別抽提以上各組織的總RNA。總RNA提取、DNase I處理和第一鏈cDNA合成等方法詳見文獻(黃左安等,2011)。根據(jù)L.c-C3和L.c-C4基因的cDNA序列分別設計一對跨內(nèi)含子的擴增引物, 選取β-actin作為內(nèi)參基因。各引物序列詳見表1。

表1　用于實時定量熒光PCR的引物序列Tab.1　Primers used for RT-PCR

熒光定量檢測試劑采用 SYBR定量檢測試劑盒(Takara公司), 實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)采用25μL 反應體系,含 SYBR Premix ExTaq (2×)緩沖液 12.5μL, 正向和反向引物(10μmol/L)各 1μL, 模板0.5μL, 滅菌水 10μL。擴增反應在Applied Biosystems 7500P熒光定量PCR儀上進行, 94°C變性180s后, 按以下程序進行 40 個循環(huán): 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s。為確保特異性擴增, PCR結束后對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析, 流程為 94°C 30s, 72°C 60s, 95°C 30s,每一個樣品技術重復3次。采用β-actin基因?qū)Ω鱾€樣本L.c-C3和L.c-C4基因表達水平進行校正, 每個樣本的檢測均重復 3次, 并測量其 Ct值。采用相對標準曲線法2–ΔΔCt(Livaket al, 2001)分析相對定量結果, 實驗結果表示為平均值±標準誤, 顯著性水平采用 SPSS18.0軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統(tǒng)計,P＜0.05為差異顯著。

2　結果與分析

2.1　L.c-C3和L.c-C4基因cDNA序列分析

L.c-C3基因 cDNA序列全長 4962個核苷酸(nucleotides, nt) (GenBank登錄號: KJ544508), 編碼一個由1653個氨基酸組成的前體蛋白。前體蛋白N端23個氨基酸為信號肽序列。利用SMART 數(shù)據(jù)庫對結構域開展檢測分析顯示, 大黃魚 C3蛋白由一個信號肽部分和8個結構域組成(圖2B所示), 詳細信息見表2。將L.c-C3基因氨基酸序列與其它硬骨魚以及人類的C3序列比對后(圖1)表明,補體C3存在多個保守位點, 其中包括一個α-β折疊位點(RXXR結構,660—663aa, 如圖2A), 一個 ANATO 結構域(由CC……C……C……CC構成, 686—722aa, 如圖2C)和一個極保守的硫酯區(qū)(GCGEQ, 1005—1009aa, 圖2C),L.c-C3與魚(Miichthys miiuy)C3的同源性最高(序列相似度為 82%), 而與其它硬骨魚類如牙鲆(Paralichthys olivaceus)、點帶石斑魚(Epinephelus coioides)、金頭鯛(Sparus aurata)和花狼魚(Anarhichas minor)的序列相似度分別為73%、73%和72%而與非洲爪蟾(Xenopus laevis)的相似度為43%, 與尤金袋鼠(Macropus eugenii)的為 42%, 與人(Homo sapiens)的則為41%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示大黃魚補體C3與鮸魚最先發(fā)生聚類, 表明親緣關系最近, 魚類 C3和哺乳動物C3分別形成兩個不同的枝系, 在魚類C3中大黃魚與魚C3首先聚類, 然后再與其它魚類的C3發(fā)生聚類(圖3)。

L.c-C4基因cDNA序列全長5088個核苷酸(已經(jīng)提交到GenBank), 編碼一個由1695個氨基酸組成的前體蛋白。前體蛋白 N 端 19 個氨基酸為信號肽序列。大黃魚C4蛋白同樣也是由一個信號肽部分和 8個結構域組成(如圖4A所示)。就結構域組成來看,L.c-C3和L.c-C4基因具有相同的結構域, 只是在序列中的位置不同, 詳細信息見表3。

將L.c-C4基因氨基酸序列與其它硬骨魚以及人類的C4序列比對后表明,L.c-C4同樣與魚(Miichthys miiuy)C4具有最高的同源性(序列相似度為92%), 而與其它硬骨魚類如雀鯛(Stegaste spartitus)、尼羅口孵非鯽(Oreochromis niloticus)和紅鰭東方鲀(Takifu gurubripes)的序列相似度分別為65%、63%和62%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示大黃魚補體C4也首先與鮸魚發(fā)生聚類, 表明親緣關系最近, 魚類C4和哺乳動物C4同樣分別形成兩個不同的枝系, 在魚類中, 大黃魚 C4與魚C4首先聚類, 然后再與其它魚類C4發(fā)生聚類,如圖5。

圖2　A. L.c-C3多重序列比較α-β鏈折疊位點部分; B. 大黃魚補體C3分子結構域分析圖; C. L.c-C3多重序列比較ANATO結構域和硫酯區(qū)Fig.2　A. α-βfolding sites of L.c-C3 of multiple sequence; B. Molecular structural domain of L.c-C3; C. ANATO structural domain and thioester domain of L.c-C3 of multiple sequence

表2　SMART數(shù)據(jù)庫預測的大黃魚C3結構域Tab.2　Prediction to the structural domain of L.c-C3 by SMART database

2.2　L.c-C3和L.c-C4基因表達特性

L.c-C3 mRNA的組織表達特異性熒光定量檢測結果如圖6所示, 在圖6中可以看到L.c-C3在大黃魚脾臟、心臟、肌肉、鰓、胃、腸、腦、肝臟這8種組織中均有表達, 其中在肝臟中的表達量特別高, 而在其它7種組織中都只有微量表達, 在這些微量表達的組織中, 脾臟和腸中的表達量相對高一些。

L.c-C4 mRNA的組織表達特異性熒光定量檢測結果如圖6所示, 如圖6所示, 肝臟和肌肉中L.c-C4 mRNA的表達量明顯高于其它組織, 說明L.c-C4 mRNA主要在肝臟和肌肉中表達, 其次是在胃、脾臟和鰓中表達。

L.c-C3 mRNA在胚胎時期各個階段的表達特征如圖7所示。由圖7可知,L.c-C3在胚胎時期的表達量并無明顯變化, 而在每個時期都有一定量的表達,在其它魚中也存在這種現(xiàn)象, 對鱈魚(Gadus morhua)(Langeet al, 2004)、牙鲆(Paralichthy solivaceu) (Langeet al, 2006)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss) (Lvollet al,2007)的研究表明 C3在多種器官和幼魚發(fā)育的不同時期均有表達。經(jīng)過用SSPS軟件進行的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示也是如此, 在組織表達差異中, 用單因素方差分析檢測得出大黃魚肝臟中C3的表達量是其它組織的成百上千倍(P＜0.01), 其它各種組織中都有表達,但無明顯差異, 在大黃魚胚胎發(fā)育的不同時期中,L.c-C3的表達量并無明顯差異, 單因素方差分析檢測得P＞0.05, 說明各個階段的表達差異并不明顯。

圖3　通過鄰近相連法構建的補體C3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　The phylogenetic tree of C3 constructed by Neighbor-Joining method

圖4　A. 經(jīng)SMART分析, L.c-C4共包含的8個結構域; B. L.c-C4多序列比對后其中ANATO結構域部分以及硫酯區(qū)部分的結果Fig.4　A. Eight domains in L.c-C4 by SMART analysis; B. ANATO structural domain thioester domain of L.c-C4 of multiple sequence

L.c-C4 mRNA在胚胎時期各個階段的表達特征如圖7所示, 在圖中可以清楚地看到L.c-C4 mRNA的表達量在眼泡出現(xiàn)期、尾芽期、初孵仔魚三個階段中的表達量明顯高于前三個階段。這說明在大黃魚胚胎發(fā)育的早期L.c-C4表達量不高, 但是隨著胚胎發(fā)育,在眼泡出現(xiàn)期表達量明顯提高。

2.3　被溶藻弧菌侵染后L.c-C3和L.c-C4基因表達變化

大黃魚被溶藻弧菌侵染后L.c-C3 mRNA在肝臟、脾臟中的表達變化如圖8A所示, 在圖8中可以看到大黃魚在被溶藻弧菌侵染后6h和48h的時候肝臟中L.c-C3的表達量明顯提高, 而在脾臟中則是在被侵染后的 12h和 24h的時候明顯提高。在肝臟中L.c-C3的表達量水平在健康的大黃魚中表達量較其它組織要高很多, 但是在溶藻弧菌感染實驗中, 對照組中L.c-C3的表達量相對于感染后的L.c-C3的表達量, 要低的多。肝臟中L.c-C3在被溶藻弧菌侵染后表達量是明顯上升的, 這說明肝臟是合成補體 C3的主要器官, 也是遇到外界細菌侵染后發(fā)生免疫反應的效應器。但是在6h和48h時主要在肝臟中表達, 而在12h和24h時主要在脾臟中表達, 這可能是多種原因綜合作用造成的。

表3　SMART數(shù)據(jù)庫預測的大黃魚C4結構域Tab.3　Prediction of the structural domain of L.c-C4 by SMART database

大黃魚被侵染溶藻弧菌后L.c-C4 mRNA在肝臟、脾臟中的表達變化如圖8B所示, 可以看出,L.c-C4 mRNA在肝臟中的變化并不明顯, 只有在被溶藻弧菌侵染后48h時, 較其它時間段的表達量升高明顯。而在脾臟中在被侵染后的 6h以后的各個時間段L.c-C4 mRNA的表達量都有明顯的升高, 造成這個結果的原因可能是由于L.c-C4在健康大黃魚的脾臟中表達量比較少, 一旦受到外界細菌的刺激, 表達量就會明顯升高。

圖5　通過鄰近相連法構建的補體C4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　The phylogenetic tree of C4 was constructed by Neighbor-Joining method

圖6　L.c-C3 mRNA, L.c-C4 mRNA在各組織中表達特征Fig.6　Expression of L.c-C3 and L.c-C4 mRNA in different tissues

3　討論

3.1　大黃魚補體成分C3和C4的全長cDNA序列分析

本文利用大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫, 獲得了大黃魚補體成分C3和C4的全長cDNA序列。序列分析表明, 大黃魚C3和C4具有已知C3、C4特征性結構, C3和C4存在翻譯后的N-糖基化修飾, 這與已報道的哺乳動物C3、C4結果一致。與哺乳動物相比, 魚類補體系統(tǒng)的研究較晚, 直到進入20世紀80年代以后才開始(Doddset al, 1993)。由于C3在補體活化途徑中的關鍵作用, 自從從人血清中分離得到第一個 C3分子后(Müller-Eberhardet al, 1960), 有關硬骨魚類和其它物種C3結構和功能的研究報道日益增多。本文利用大黃魚基因組數(shù)據(jù)庫, 獲得了大黃魚補體成分C3和C4的全長cDNA序列。序列分析表明, 大黃魚C3和C4與哺乳動物的C3、C4存在明顯的相同和差異性。在結構上, 大黃魚C3和哺乳動物C3一樣, C3轉(zhuǎn)化酶的剪切位點都是Arg-Ser; 都存在兩條肽鏈(α鏈和β鏈), 并且α鏈上都存在硫酯部位; 與硫酯催化反應相關的殘基都是組氨酸。在人C3中,Pro1007和Pro1020在形成穩(wěn)定的硫酯鍵時是必不可少,Glu1128在決定硫酯結合的特異性方面起著重要的作用(Zarkadiset al, 2001), 在大黃魚C3中也是如此。在所有脊椎動物的C3中, 處于催化部位、在功能上比較重要的殘基主要是組氨酸, 但在某些同種異型中催化性組氨酸可被不同的殘基所取代, 例如鯉 C3-S基因型中的絲氨酸、虹鱒C3-4基因型中的蘇氨酸、鯉C3-Q1和 C3-Q2基因型中谷氨酰胺相應地取代了催化性組氨酸。研究表明, 高等動物和低等動物不僅在氨基酸序列方面存在差異, 而且在C3受體特異性、C3對熱的敏感性以及C3的溶血活性方面也不同(Alsenzet al,1992; Zarkadiset al, 2001)。但有關大黃魚C3的功能尚有待進一步研究。

圖7　L.c-C3 mRNA, L.c-C4 mRNA在大黃魚胚胎時期各階段的表達特征Fig.7　Expression characteristics of L.c-C3 and L.c-C4 mRNA in different phases of embryonic period

圖8　A. 被溶藻弧菌感染后L.c-C3 mRNA在肝臟和脾臟中的變化; B. 被溶藻弧菌感染后L.c-C4 mRNA在肝臟和脾臟中的變化Fig.8　Effects of L.c-C3 mRNA in liver and spleen infected by V. alginolyticus; B. Effects of L.c-C4 mRNA in liver and spleen infected by V. alginolyticus

系統(tǒng)進化樹分析表明, 魚類 C3和 C4與哺乳類C3和 C4都分別形成各自的枝系, 大黃魚 C3和 C4與鮸魚的C3和C4最相似, 這與兩者的在分類關系上親緣關系最近的特點相一致。

3.2　L.c-C3和L.c-C4基因表達特性分析

組織表達特征研究揭示, 健康大黃魚 C3和 C4基因mRNA在肝中表達量都很高, C4在肌肉中也有一定量表達, 但在腸、鰓、心臟、腦中只有少量表達。補體是魚類抵抗微生物感染的重要成分, 激活后具有機體靶細胞溶解和調(diào)理作用, 而C3、C4是補體系統(tǒng)的主要成分。實驗結果表明大黃魚的肝臟中的補體C3、補體C4的含量最高, 其它的組織中也能檢測出補體 C3、C4, 這與在鱈魚(Gadus morhuaL)幼魚(Langeet al, 2004)、庸鰈(Hippoglossus hippoglossusL)幼魚(Langeet al, 2006)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Lvollet al, 2007)的結論相似, 說明肝臟是補體分泌主要部位。而多斑狼魚(Anarhichas minorOlafsen)的補體C3僅在肝臟中表達(Ellingsenet al, 2005), 這可能與魚種品種和生長環(huán)境有關。

胚胎發(fā)育過程中不同發(fā)育階段的補體 C3和 C4表達特征的研究表明, 在其過程中補體 C3的表達量沒有變化, 說明其在胚胎發(fā)育過程中很可能沒有發(fā)揮作用, 而補體 C4在胚胎發(fā)育的后期階段表達量明顯提高, 這可能與即將要孵化面臨外界的刺激有關。

3.3　經(jīng)溶藻弧菌感染后的大黃魚L.c-C3和L.c-C4基因表達特性分析

本文研究表明, 經(jīng)溶藻弧菌侵染后, 肝組織中C3基因mRNA顯著增加, 6h時達到峰值, 在12h和24h時, C3基因的mRNA在脾中的表達量顯著增加,到48h時肝臟和脾臟中的C3表達量仍顯著高于對照組, 在對照組的肝組織中, 在大黃魚體內(nèi)補體 C3的表達微量; 而在感染有溶藻弧菌的大黃魚肝組織中,檢測到L.c-C3大量表達。這說明受到病原體的侵襲,肝臟大量合成補體C3。在硬骨魚類中, 已有研究表明,補體除了具有溶菌、中和外毒素(Sakai, 1984a, b)、溶解寄生蟲(Bower, 1988)等直接的抗微生物作用外, 還顯示出對吞噬細胞吞噬活性的促進作用, 即所謂調(diào)理作用。Buchmann(1998)發(fā)現(xiàn)補體C3可通過旁路途徑殺死體內(nèi)的寄生蟲; Harris等(1998)曾報道虹鱒血清或黏液中的補體對體內(nèi)的寄生蟲具有殺傷作用;Matsuyama等(1992)證實鯉補體的調(diào)理作用是由于C3的作用而引起的。溶藻弧菌對魚、蝦、貝等都有較強的致病性, 溶藻弧菌的感染可引起大黃魚產(chǎn)生魚體發(fā)白, 體表點狀發(fā)紅, 下頜、眼球、腹部、以及各鰭基發(fā)紅, 鰭條散列, 肝臟、腎臟、脾臟充血腫大。本研究利用RT-PCR技術顯示感染溶藻弧菌的大黃魚肝組織中存在補體 C3的表達明顯上調(diào), 因此推測L.c-C3在抗溶藻弧菌的感染中具有一定的作用, 但其對溶藻弧菌的作用途徑有待深入研究。

受溶藻弧菌侵染后, 肝組織中C4基因的mRNA的表達量也有所增加, 但在脾臟中在12h以后都顯著高于對照組, 揭示肝組織大量合成 C3, 脾臟中可以大量合成 C4。組織 RT-PCR顯示正常狀態(tài)下, 大黃魚補體 C4 基因只在在肝和肌肉組織中表達量比較高, 這與哺乳動物的表達特征相同。在哺乳動物中,C3與C4、C5同源, 這三個分子與血清蛋白酶抑制因子α2M(α-2-macroglobulin)以及血細胞的 GPI錨定膜蛋白 CD109 (Linet al, 2002)同屬于一個家族——硫酯包含蛋白家族。感染溶藻弧菌12h后, 大黃魚的脾中補體C4基因表達明顯提高, 說明大黃魚補體C4對溶藻弧菌具有快速響應作用, 大量表達 C4以抵御溶藻弧菌的攻擊。隨著時間的推移, 大黃魚補體 C4基因表達量也隨之上升, 表現(xiàn)在感染72h后, 肝組織中基本停止表達有所降低, 而脾中表達量仍然很高(圖8B)。由此推測, 大黃魚補體C4在對抗溶藻弧菌的感染中具有重要作用, 但其對溶藻弧菌的作用途徑還有待深入研究。

綜上所述, 本文首次報道了大黃魚補體成分 C3和C4基因的cDNA全序列, 并利用RT-PCR技術對其組織表達特異性, 不同發(fā)育階段的表達變化, 以及感染溶藻弧菌的大黃魚的肝臟和脾臟中的表達量變化與過程進行了相關研究, 為魚類抗細菌免疫的深入研究奠定了基礎。

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