肺纖維化動物模型的研究進展

楊曉燕，沈杰,2

1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海市光華中西醫結合醫院，上海 200052

間質性肺炎是類風濕性關節炎常見的并發癥，增加了類風濕性關節炎6%的死亡率[1]。目前關于類風濕性關節炎并發間質性肺炎缺乏療效肯定的治療方案。在探索類風濕性關節炎相關間質性肺疾病治療的實驗研究中，合適的動物模型是成功的重要條件。研究表明，類風濕性關節炎相關間質性肺疾病最常見的病理類型是普通型間質性肺炎（usual interstitial pneumonitis，UIP）[2-3]，在實驗造模中常參考肺間質纖維化的動物模型。但仍缺乏特異性的，與類風濕性關節炎相關間質性肺炎發病機制及病理類型更接近的動物模型。在此，我們將就目前較常用的肺纖維化動物模型的建立方法進行簡要總結。

1 博來霉素誘導肺纖維化動物模型

目前國際上應用最為廣泛的就是博來霉素誘導肺纖維化動物模型。博來霉素是從輪枝鏈霉菌中提取的一種抗腫瘤藥物，我國從放線菌菌株72號中分離出同樣的抗生素。作為抗腫瘤藥物，博來霉素應用于臨床時常見的副作用是引起肺炎及肺纖維化癥狀，因而是肺纖維化動物模型最常用的誘導劑。在實驗中常用的是日本生產的博來霉素，國內也有研究者采用國產的平陽霉素，平陽霉素是博來霉素的單體，其毒性較小。

1.1 動物品系的選擇

劉蓉[4]等采用氣管內注射博萊霉素的方法，比較BALB/c、C57BL/6及KM小鼠3種品系的肺纖維化的程度，光鏡下觀察各模型組肺組織均呈不同程度的纖維化，C57BL/6小鼠最明顯；BALB/c小鼠肺纖維化模型組肺損傷程度及纖維化程度較輕，成功率僅70%；KM 小鼠肺纖維化程度介于二者之間，且有2只小鼠未出現肺纖維化。C57BL/6小鼠肺纖維化的程度較為理想。也有人比較了C57BL/6與ICR 小鼠2 種品系的造模效果，采用經尾靜脈一次性注射博來霉素150 mg/kg 的方法誘導2 種種屬的小鼠肺間質纖維化，結果C57BL/6 組小鼠出現明顯的肺間質纖維化，ICR 組小鼠未見明顯纖維化形成，2 組之間存在著明顯的差異。說明C57BL/6 小鼠較ICR 小鼠更適于博來霉素誘導的肺纖維化動物模型[5]。國外研究中也多采用C57BL/6小鼠建立肺纖維化動物模型。C57BL/6小鼠是小鼠肺纖維化模型中最常用的小鼠品系。

大鼠也是肺纖維化模型常用動物[6]。至于品系，未見相關文獻比較SD 大鼠與Wistar 大鼠在肺纖維化模型建立中的差異。國內實驗研究中，2 種大鼠均常用于肺纖維化模型的建立[7-9]。

1.2 造模方法的選擇

目前最常用的博來霉素誘導肺纖維化動物模型的方法是一次性氣管內灌注。氣管內灌注又分為直接灌注和間接灌注。直接灌注法是通過氣管插管向動物氣管內灌注博來霉素；間接灌注法是在動物頸部切口，鈍性分離，找到氣管后向氣管內注入博來霉素。2 種方法在灌注后都需要將小鼠旋轉，以便藥物在肺部能夠分布均勻，肺部纖維化程度均勻。李偉峰、王聰等使用MicroSprayere 霧化器（美國PENN-CENTURY）氣管內霧化的方法建立動物模型，并與氣管內滴注方法相比較，結果顯示2種方法均能夠引起肺纖維化，但氣管內滴注組小鼠肺纖維化程度不一，病灶分布不均；而氣管內霧化組小鼠肺纖維化病灶分布均勻，更適合用于小鼠肺纖維化模型[10-11]。國外研究者[12]也使用了這種霧化裝置向大鼠氣管內霧化博來霉素，誘導大鼠肺間質纖維化，降低了大鼠感染的風險，提高了造模成功率及肺內纖維化病灶分布的均勻程度。但這種裝置價格較貴，成本高。周歡[13]使用同種微型霧化器氣管內霧化建立肺纖維化動物模型，雖然復制出肺纖維化模型，但成功率及肺纖維化均勻程度并不高，且操作復雜。國內也有學者使用其他造模方法，如霧化吸入、經鼻滴注、尾靜脈注射、腹腔注射等。劉珊[14]等比較了霧化吸入和氣管內灌注方法建立的肺纖維化模型，認為霧化吸入法操作簡便，吸入藥物在肺內分布均勻，是一種較為理想實用的肺纖維化造模方法。該實驗研究分別設置了霧化吸入2.5 g/L（0.25%）博來霉素稀釋液15 min、1 h、2 h、6 h 組，實驗結果顯示15 min、1 h、2 h 組小鼠均無明顯的肺纖維化，僅霧化6 h 組小鼠病理可見明顯的肺纖維化，因此推斷提高博來霉素濃度5 g/L（0.5%），并將霧化時間定為3 h可能獲得理想的肺纖維化模型。但該推斷并未獲得證實，且5 g/L（0.5%）博來霉素霧化3 h需要消耗大量的博來霉素，提高了成本。盡管霧化吸入可以使小鼠肺纖維化分布均勻，但霧化吸入并不能確定每只小鼠吸入的博來霉素量，不能很好地控制小鼠的肺纖維化程度，且霧化時間過長，造模需要消耗大量時間。因此，霧化吸入在實驗中的應用并不多。高占成[15]等在通過連續3 d 鼻滴入博來霉素的方法建立了肺纖維化動物模型，但胡靜[16]等應用高占成的方法并未成功地建立模型，他們改良了這種造模方法，一次性鼻滴入博來霉素，建立了肺纖維化模型。不過，該實驗并未設置氣管內滴注組與鼻滴入法對照，雖然鼻滴入較氣管內滴注操作簡便，對小鼠損傷較小，但尚缺肺纖維化程度的比較。孟婕[17-18]等研究了連續多次尾靜脈注射博來霉素造模的方法，并與氣管內灌注法對比，兩者均能成功地復制出肺纖維化模型，但尾靜脈注射組病灶主要分布在胸膜下及血管周圍，而氣管內灌注組主要分布在支氣管和細支氣管周圍，尾靜脈注射組病灶的分布特點更接近于特發性肺纖維化，且尾靜脈注射法小鼠病死率較低，但連續多次尾靜脈注射操作不如一次性氣管內灌注簡便。楊聰穎、肖強[19-20]等通過對比不同劑量一次性尾靜脈注射及多次尾靜脈注射的造模方法，認為尾靜脈單次注射博萊霉素200 mg/kg 可有效誘導肺纖維化，復制一個相對穩定的肺纖維化模型。這種方法相對于多次尾靜脈注射方法簡便得多，但用藥劑量較大。此外，齊曼古麗·吾守爾[21]對比了腹腔注射與氣管內灌注的方法，認為腹腔內給藥法具有給藥次數多、劑量大、制模時間長等缺點，但動物死亡率相對較低，且操作簡便，病灶分布均勻。值得一提的是，以上經鼻滴入、尾靜脈注射方法建立的模型均采用ICR 小鼠，可見小鼠品系的選擇并不絕對，與造模方法有關。

1.3 藥物劑量的選擇

氣管內灌注博來霉素誘導動物肺纖維化模型的方法雖然最常用，但博來霉素的用量國內外尚無統一標準。陶章[22]等分別用2、3.5、5 mg/kg 博來霉素造模，3 組均能成功地建立小鼠肺纖維化模型，但5 mg/kg組動物死亡率較其余2組高，綜合考慮肺纖維化程度及小鼠的生存率，作者認為選取3.5 mg/kg博來霉素誘導小鼠肺纖維較為合適。鼻滴入、尾靜脈注射、腹腔注射等方法因對動物損傷較小、死亡率低，尚未見關于這幾種造模方法藥物劑量選擇的研究報道。

2 百草枯誘導肺纖維化動物模型

近年來，國內不少研究者使用百草枯誘導動物肺纖維化。百草枯為聯吡啶類化合物，化學名為1，1-二甲基-4，4'-聯吡啶鎓鹽，是一種速效觸殺除草劑。百草枯中毒的靶器官主要是肺臟，百草枯中毒后除急性死亡外，非急性死亡的病人多在15～30 d發生肺纖維化[23-24]。

2.1 動物品系的選擇

使用百草枯誘導動物肺纖維化常選用的動物有小鼠、大鼠、家兔等。楊珊珊[25]等通過分別對KM、ICR及C57BL/6J小鼠腹腔注射百草枯溶液10 mg/kg或20 mg/kg 建立肺纖維化模型，28 d 后處死小鼠，在光學顯微鏡下發現KM 小鼠及ICR 小鼠肺組織均無明顯纖維化改變，僅C57BL/6J小鼠部分區域有輕度纖維化形成。說明3 種小鼠中，C57BL/6J 小鼠更適合小鼠肺纖維化模型的建立。但該實驗選用的是腹腔注射的造模方法，如果選用氣管內灌注方法進行造模，也許結果不盡相同。關于動物品系的選擇，C57BL/6J 小鼠是國內外應用較為廣泛的品系，幾乎適用于各種造模方法，但這并不能說明其他小鼠一定不能用來建立肺纖維化模型，這可能與造模方法有很大的關系，還需要更多的實驗研究來證實。

2.2 造模方法的選擇

使用百草枯建立肺纖維化模型，常見報道有一次性口服灌注、腹腔注射等造模方法。高燕[26]等選用KM小鼠，通過一次性灌胃百草枯100 mg/kg的方法建立肺纖維化模型，結果病理提示造模組肺組織3 d 時已出現嚴重炎性反應，21 d 時肺組織呈明顯的纖維化改變。一次性口服灌胃方法操作簡便，對動物損傷小，可用來進行肺纖維化的發病機理和藥物療效研究。尹江寧[27]也選用了一次性灌胃的方法建立了兔肺纖維化模型。楊珊珊[24]等選用一次性腹腔注射百草枯，盡管C57BL/6J小鼠組出現了肺纖維化，但程度輕，造模結果并不理想，可能與百草枯劑量過小有關。祝春青[28]等通過實驗對比了一次性腹腔注射各劑量組的造模效果，結果各染毒組均出現不同程度的肺纖維化改變，且注射劑量越高，肺纖維化病變越嚴重，早期死亡率也越高。綜合各方面考慮，一次性腹腔注射百草枯40～50 mg/kg 可制備較合適的小鼠肺纖維化模型。

3 其他

除上述較常用的博來霉素及百草枯造模方法以外，也有研究者采用鹽酸模擬酸流吸入后對肺部造成的影響，觀察鹽酸（胃酸的主要成分）對肺部造成的損傷，建立肺纖維化模型[29]。有人選用氣管內一次性注射攜帶TGF-β1 基因的腺病毒載體（AdTGFβ1223/225）誘導大鼠肺間質纖維化。腺病毒誘發的肺纖維化具有發病急、炎癥反應強烈、細胞外基質增生迅速、膠原纖維彌散度高等特點，這些特點與特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）病理過程極為相近，有望成為研究IPF 發病機制的可靠動物模型[30]。也有人選用金黃色葡萄球菌L 型致間質性肺炎的實驗動物模型[31]，但該實驗方法會造成小鼠多器官臟器發生間質性炎癥改變，不適合間質性肺炎的動物模型。

目前國內外最常用、最受認可的肺纖維化模型仍是一次性氣管內灌注博來霉素誘導的動物肺纖維化[32]。然而這種方法操作技術要求高，動物耐受差，死亡率高，造成的肺纖維化病灶分布不均勻，尚須改進方法，改善造模效果，提高動物生存率。國內研究中的其他造模方法，也需要更多的實驗證明其可重復性、可靠性。總之，需要探尋一種操作更簡便、更安全、可重復性高、肺纖維化分布更均勻、與肺纖維化臨床及病理特點更相似的動物模型。

類風濕性關節炎相關間質性肺炎的發病機制尚不明確，研究表明可能與類風濕性關節炎患者免疫異常有關[33]。雖然類風濕性關節炎并發間質性肺炎的病理類型多為普通型間質性肺炎，這與我們常用的肺纖維化動物模型的病理類型相一致，但其發生機制與特發性肺間質纖維化可能存在差異。這就給類風濕性關節炎并發間質性肺炎的動物實驗研究造成了困難。我們需要更多的研究來探索一種更貼近于類風濕性關節炎并發間質性肺炎臨床特點的動物模型，以便于研究類風濕性關節炎并發間質性肺炎的發病機制及治療方法。

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