益氣解毒活絡中藥復方對糖尿病大鼠腎臟病理組織結構的影響*

付 曉，李敬林

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)針灸科，遼寧錦州 121001; 2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院老年病科，沈陽 110032)

益氣解毒活絡中藥復方對糖尿病大鼠腎臟病理組織結構的影響*

付 曉1，李敬林2

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)針灸科，遼寧錦州 121001; 2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院老年病科，沈陽 110032)

目的:探討益氣解毒通絡中藥復方(YQJDHL)對糖尿病(DM)大鼠腎臟結構的影響。方法:SPF級健康雄性SD大鼠72只，注射鏈脲佐菌素造成糖尿病及痰濁瘀毒中醫(yī)證候模型。應用YQJDHL分別在造模成功及成模后2周灌胃給藥，觀察大鼠腎臟病理組織學變化。結果:YQJDHL能夠減輕糖尿病腎病(DN)大鼠腎小球肥大、系膜細胞增生等病理改變，中藥預防組療效優(yōu)于中藥治療組。結論:YQJDHL能夠預防和治療大鼠早期DN，其機制可能與延緩腎臟病理組織損害有關。

益氣解毒活絡中藥復方;糖尿病腎病;大鼠

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最重要和最常見的并發(fā)癥之一，是慢性腎衰最常見的病因及DN患者死亡的主要原因。中醫(yī)藥防治早期DN有一定的臨床療效，但其病理機制和療效機理尚未完全闡明［1］。遼寧省名醫(yī)李敬林教授長期應用益氣解毒活絡法及其方藥治療早期DN取得良好的臨床療效。本研究旨在觀察益氣解毒活絡(YQJDHL)中藥復方對實驗性糖尿病大鼠早期腎臟結構的影響，探討可能的機制，為臨床防治DN提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

選擇健康雄性SPF級SD大鼠72只，體質量(200±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證號0194036)，大鼠一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，進食與活動正常。

1.2 環(huán)境及飼料

1.2.1 飼養(yǎng)環(huán)境 遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級實驗室籠養(yǎng)，室內(nèi)通風及光線良好，溫度、濕度適宜。

1.2.2 動物飼料 普通飼料配方:40%玉米面，26%白面，10%麩子，10%魚粉，10%豆餅，2%礦物質，1%粗鹽，1%復合維生素，購于沈陽市于洪區(qū)前民飼料廠。高糖高脂飼料配方:61.5%普通飼料，20%蔗糖，10%豬油，5%蛋黃粉，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，由沈陽市于洪區(qū)前民飼料廠配制。

1.3 藥物

1.3.1 受試藥物 YQJDHL中藥復方，由黃芪30 g、黃精50 g、黃連9g、虎杖15 g、澤蘭30 g、水蛭粉6 g組成。免煎中藥配方顆粒組成由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥局提供，江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。臨用時蒸餾水配制成含生藥3 g/ml濃度湯劑。

1.3.2 西藥對照藥物 鹽酸貝那普利片(洛汀新)由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)(批號X1496，規(guī)格10 mg/片)。將藥物搗碎后用生理鹽水溶解，配成0.09 g/L濃度，按1 ml/100 g(體質量)劑量，每日灌胃1次。

1.3.3 造模藥物 STZ為美國Sigma公司生產(chǎn)，購于沈陽博瑞斯特商貿(mào)有限公司，臨用前用0.1 mol/L無菌枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖液(PH 4.2)配制成濃度為10 mg/ml的STZ液。

1.4 主要儀器

LEICA-RM2235型超薄切片機:瑞典;顯微攝影機:Nikon UFX-II型，日本;照相機:Nikon FX-35型，日本。

2 方法

2.1 動物模型的建立

造模組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，使體質量達到300 g以上;禁食12 h，按照35 mg/kg(體質量) STZ單次尾靜脈注射(注射前用0.1 mol/L無菌枸櫞酸緩沖液(pH4.2)配制);正常組注入等量的無菌枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后斷尾取血，測大鼠全血空腹血糖≥16.7 mmol/L者確定為DM模型，血糖穩(wěn)定1周后列入觀察對象。造模期間有5只大鼠血糖值偏低未列入觀察對象，成模率為91.94%(57/ 62)。

2.2 動物分組及給藥方法

將成模的57只大鼠按照血糖值再次進行隨機分組，分為模型組13只，中藥預防組11只，中藥低劑量治療組11只，中藥高劑量治療組11只，陽性西藥對照組11只。模型組及各治療組觀察2周后測大鼠空腹血糖值，代謝籠收集大鼠24 h尿液待測尿微量白蛋白值(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科檢測)。注射STZ 2周后，除中藥預防組外，模型組2只大鼠、中藥低劑量治療組與陽性西藥對照組各有1只大鼠血糖值恢復至正常值以下，均舍棄不用。

正常組和模型組給予等量生理鹽水2 ml灌服;將中藥顆粒劑溶于蒸餾水中，中藥預防組、中藥低劑量治療組及陽性西藥對照組大鼠每日用藥量按人體(g/kg)－大鼠體表面積比值的等效劑量，即6.3倍計算;中藥高劑量治療組的用藥量為中藥低劑量治療組的3倍。中藥預防組在注射STZ成模后立即開始灌服中藥復方，共計給藥6周;中藥低劑量治療組、中藥高劑量治療組及陽性西藥對照組均在成DM模2周后灌胃給藥，共計給藥4周。實驗期間自由飲水，不使用胰島素和其他降糖藥。

2.3 取材

實驗結束代謝籠收集尿液后，大鼠禁食不禁水12 h，上午9時稱重，10%水合氯醛3 ml/kg體質量腹腔注射麻醉大鼠，置于解剖臺上，取仰臥位于腹部切開皮膚，剝離腹腔臟器露出腹主動脈，行腹部主動脈穿刺取血。大鼠處死后剝離并迅速取出雙側腎臟，生理鹽水清洗，濾紙吸去臟器表面血液，去除包膜;將左腎縱向對半剖開，一半置于多聚甲醛中固定，待用于組織形態(tài)學和免疫組織化學光鏡檢查。

2.4 指標檢測和方法

用生理鹽水清洗取出腎組織，濾紙吸去臟器表面液體，除去包膜在4%多聚甲醛中固定24 h，75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水12 h，50～60℃的蠟浸1～2 h，標本包埋，制作成蠟塊，冷臺冷凍2 h后，LEICA-RM2235型超薄切片機切成5 μm厚度的薄片，按實驗分組進行編號，置于70℃烤片機中烤片2 h;切片脫臘至水:二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、85%、70%乙醇各5 min;蒸餾水洗2 min，蘇木素(HE)染色10 min，自來水沖洗;1%鹽酸酒精分化1 min，自來水沖洗，0.5%氨水返藍30 min;自來水沖洗，伊紅染液5 min;70%、80%、90%、95%乙醇各3 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，中性樹膠封固;光學顯微鏡下觀察腎臟的基本病理變化并拍照。

3 結果

腎組織光鏡病理形態(tài)學觀察，HE染色、腎組織細胞核在光鏡下呈現(xiàn)紫藍色，細胞漿、腎小球基底膜(GBM)和膠原纖維呈粉紅色。正常組可見正常腎小球，細胞未見明顯增大或萎縮，腎小球系膜區(qū)較窄，ECM與系膜細胞分布正常，毛細血管腔呈現(xiàn)開放狀態(tài)，紅細胞滿視野。模型組大鼠腎臟體積多數(shù)增大，光鏡下可見腎小球細胞增大明顯，GBM增厚，部分腎小球系膜細胞呈中度增生、系膜區(qū)增寬，部分腎小管出現(xiàn)上皮空泡變性，管腔內(nèi)可見蛋白樣物。經(jīng)干預治療后，各治療組大鼠上述病變均有不同程度改善;腎臟體積與模型組比較大多減小，但仍較正常組腎臟有所增大;光鏡下可見，腎小球細胞輕度增大，GBM輕度增厚、系膜區(qū)輕度增寬及腎小管空泡變等病變范圍，與模型組比較小且輕，未見腎小球硬化及腎間質纖維化。治療組間未見明顯差異(見圖1)。每個樣本分別在腎臟皮質與近髓質區(qū)隨機取5個腎小球，觀察腎臟系膜細胞的增生情況。分級標準參照鄭旭［2］等分級方法，將腎小球系膜增生分為0～Ⅲ級。0級:正常腎小球系膜細胞;Ⅰ級:系膜增生寬度小于毛細血管直徑，呈節(jié)段性分布;Ⅱ級:系膜增生寬度大于毛細血管直徑，呈彌漫性分布;Ⅲ級:系膜增生寬度呈團塊狀聚集，彌漫指狀分布，擠壓血管腔。腎組織半定量分析結果顯示，經(jīng)YQJDHL中藥復方治療后的中藥實驗組和陽性對照組分別與模型組比較，腎臟病理損傷均明顯減輕(P＜0.05);中藥實驗組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明實驗大鼠注射STZ后，大鼠腎臟出現(xiàn)較明顯的病理損害，而給予YQJDHL中藥復方治療后，病理損害明顯減輕。

圖1 成模后4周末各組大鼠腎臟病理的變化(HE染色，光鏡×200)

4 討論

根據(jù)DN的病因病機及臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)“腎消”、“尿濁”、“腎勞”、“水腫”、“消渴”等范疇［3］。中醫(yī)理論認為，DN的成因多是由于先天不足、后天失養(yǎng)。先天不足主要為腎精虧虛所致，后天失養(yǎng)多為飲食不節(jié)、情志失調、過勞過逸所致。中醫(yī)學對DN病機的認識不一，但多數(shù)認為DN乃本虛標實之證。本虛多指氣血陰陽不足及五臟虧虛;標實則指痰濕、濁毒、瘀血等病理產(chǎn)物堆積。李敬林教授結合其多年對DN的臨床研究，認為早期DN患者乃脾腎虧虛、氣陰兩傷、痰濕濁毒、瘀血損傷腎絡所致，故治療以益氣解毒活絡立法，自擬YQJDHL中藥復方，臨床治療DN療效確切［4］。方中黃芪益氣固表、利尿托毒、排膿斂瘡生肌;黃精味甘、性平，益氣養(yǎng)陰、健脾益腎、潤心肺、強筋骨;黃連清熱燥濕、瀉火解毒;澤蘭活血、通經(jīng)、利尿，為治療消渴瘀阻水停之良藥;水蛭具有破血、逐瘀、通經(jīng)之功效。上述藥物巧妙組合，取其益氣補腎、健脾潤肺、清熱解毒、活血通絡之功，體現(xiàn)了中醫(yī)學對DN“扶正祛邪、標本兼治”的治療大法。

實驗結果顯示，應用具有益氣健脾、祛痰解毒、活血通絡作用的中藥復方能夠減輕腎臟肥大及腎小球系膜基質增生、硬化，早期應用作用尤為顯著，表明益氣解毒活絡中藥復方能夠預防和治療大鼠早期DN。本研究為臨床應用益氣解毒活絡法防治DN提供了實驗理論基礎。

［1］付曉，李敬林.中醫(yī)藥綜合治療早期DN臨床療效觀察類文獻質量初步分析［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2011，17(4): 409-410.

［2］鄭旭，羅杰，楊文英，等.一氧化氮在糖尿病腎病中的作用［J］.中華腎臟病雜志，1999，15(4):91-94.

［3］封翠云.DN的中醫(yī)病名探討［J］.國醫(yī)論壇，2007，22(2): 22.

［4］李敬林，王東.從“脾主運化”論治消渴［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2002，8(12):43-44.

Effect of Yiqi Jiedu activating effects of Chinese medicine compound on the structure of kidney in diabetic rats

FU Xiao1，LI Jing-lin2
(1.Acupuncture and Moxibustion Department of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China;2.Geriatrics Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang，Liaoning 110032，China)

Objective:To investigate the effects of Yiqi Jiedu activating Chinese herbal compound(YQJDHL)on structure of kidney of experimental diabetes mellitus(DM)rats.Methods:72 SPF healthy male SD rats，each treatment group were injected STZ causing diabetes and phlegm，stasis and poison in syndrome model.Application of YQJDHL after DN model taking shape and taking shape for 2 weeks，low and high dose groups of traditional Chinese medicine and western medicine group were fed Chinese herbal compound.The pathological changes of rat kidney was observed.Results: YQJDHL can relieve diabetic nephropathy(DN)in the rat glomerular hypertrophy，glomerular mesangial cell proliferation and renal tubular epithelial cavity，such as Chinese medicine prevention treatment group is superior to the traditional Chinese medicine treatment group.Conclusion:YQJDHL can prevent and treat early DN rats，the mechanism may be related to delay the renal pathological tissue damage.

Yiqi Jiedu Huoluo Chinese herbal compound;Diabetic nephropathy;Rat

R255.4

B

1006-3250(2015)01-0047-03

2014-09-19

國家自然科學基金資助項目(30973778);遼寧省自然科學基金資助項目(2013022014)

付 曉(1974-)，女，錦州人，副主任醫(yī)師，副教授，醫(yī)學博士，從事中西醫(yī)結合防治糖尿病及其慢性并發(fā)癥的臨床與研究。