經側腦室給予中藥對慢性心衰大鼠血流動力學與神經內分泌因子的影響*

秘紅英，唐思文，賈存勤，徐登峰，郎艷松，賈振華

(1．河北醫科大學，石家莊 050017;2．河北以嶺醫藥研究院，國家中醫藥管理局重點研究室/心腦血管絡病，石家莊 050035;3．河北省中西醫結合醫藥研究院，石家莊 050035; 4．河北醫科大學附屬以嶺醫院/國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科，石家莊 050035)

經側腦室給予中藥對慢性心衰大鼠血流動力學與神經內分泌因子的影響*

秘紅英1，2，唐思文2，賈存勤2，徐登峰1，2，郎艷松1，2，賈振華1，3，4△

(1．河北醫科大學，石家莊 050017;2．河北以嶺醫藥研究院，國家中醫藥管理局重點研究室/心腦血管絡病，石家莊 050035;3．河北省中西醫結合醫藥研究院，石家莊 050035; 4．河北醫科大學附屬以嶺醫院/國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科，石家莊 050035)

目的:觀察采用微量注射泵經側腦室給予中藥芪藶強心膠囊對慢性心衰大鼠血流動力學、神經內分泌因子的影響。方法:采用結扎冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗死致大鼠心衰模型，造模4周后經側腦室分別給予芪藶強心腦脊液和芪藶強心溶液，以陽性藥CRH競爭性抑制劑(αh-CRH)作為對照，給藥4周后應用頸動脈插管測定各組大鼠血流動力學指標，ELISA法檢測大鼠血清腦利鈉肽(BNP)、血漿去甲腎上腺素(NE)，RT-PCR法檢測下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)mRNA與腦垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)mRNA的表達。結果:芪藶強心腦脊液組、芪藶強心溶液組、陽性藥組均可改善心衰大鼠血流動力學，降低大鼠血清BNP、血漿NE，并可降低下丘腦組織CRH mRNA與腦垂體組織ACTH mRNA的表達。結論:經側腦室給予復方中藥芪藶強心可有效改善大鼠血流動力學，降低血液中神經內分泌因子的含量與下丘腦CRH mRNA、腦垂體ACTH mRNA的表達，影響心衰大鼠中樞改變，有助于治療心衰。

慢性心力衰竭;下丘腦;腦垂體;促腎上腺皮質激素釋放激素

心力衰竭(HF)是冠心病、高血壓等多種心血管疾病的“共同終末階段”［1］。近年來，心衰機制的研究不斷深入，研究者發現中樞神經系統在心衰的發生發展過程中起著重要作用，尤其是下丘腦部位，在調節交感神經活動和神經體液信號方面發揮著關鍵作用。隨著心衰機制研究的轉變，對于心衰的治療也從外周給藥轉向中樞給藥，使藥物直接作用于中樞神經系統，影響中樞的改變，并由單純的西醫治療轉向中西醫結合治療，中藥復方芪藶強心膠囊對心衰的治療療效日益突出。本實驗采用微量注射泵經心衰大鼠側腦室連續給藥4周，觀察芪藶強心膠囊對心衰大鼠血流動力學、腦利鈉肽(BNP)、去甲腎腺素(NE)、下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)mRNA和腦垂體促腎上腺皮質激素(ACTH) mRNA表達的影響，探討其對中樞系統及神經內分泌因子的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用SPF級SD雄性大鼠90只，體質量220～250 g，由北京富豪實驗動物養殖中心提供(許可證號SCXK(京)2009-0017)。

1.1.2 藥物 ①復方中藥芪藶強心膠囊由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供，藥物組成為黃芪、人參、附子、丹參、葶藶子、澤瀉、玉竹、桂枝、紅花、香加皮、陳皮(批號120201)。注入大鼠側腦室的芪藶強心膠囊粉經藥學方法醇化，并用人工腦脊液配置成濃度20 mg/ml的溶液。含芪藶強心的腦脊液是在用0.1 g/ml的芪藶強心溶液灌胃(按1 g/kg劑量灌胃)新西蘭兔后，在30'、60'、90'、150'分別取腦脊液將其混合，經藥學方法檢測腦脊液中含有芪藶強心成分后使用;②人工腦脊液(ACSF):NaHCO32184 mg/L、KCl 245.85 mg/L、KH2PO4163.2 mg/L、NaCl 7254 mg/L、MgSO4288 mg/L、CaCl2277.5mg/L、葡萄糖1800 mg/L(湖州英創生物科技有限公司，批號13061901);③陽性藥αh-CRH，其可抑制下丘腦CRH的釋放，對心衰產生影響［2］(美國Sigma公司，批號119K4839)。

1.1.3 主要試劑 大鼠BNP酶聯免疫吸附試驗試劑盒，北京艾迪康醫學檢驗研究所(批號E02B0452);大鼠NE酶聯免疫吸附試驗試劑盒，河北博海生物科技有限公司(批號201308)。

1.1.4 主要儀器 腦立體定位儀，淮北正華生物儀器有限公司;ZH-RXZ型柔性顱骨鉆，淮北正華生物儀器有限公司;HX-300小動物呼吸機、BL-420E生物機能實驗系統，成都泰盟科技有限公司;微量注射泵，DURECT公司;756型紫外分光光度計，美國 Thermo公司;ABI 7300 Real-Time PCR System，美國ABI公司;RS-28高速低溫離心機，德國賀利氏公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 先將90只大鼠按隨機數字表法分為3組，正常組15只，假手術組15只和造模組60只。造模組大鼠經心臟左心耳下距主動脈根約1.5 mm處結扎左冠狀動脈前降支(假手術組只穿線不結扎)，具體方法參考文獻［3］。造模4周后，將造模組大鼠按隨機數字表法分為模型組、陽性藥組、芪藶強心腦脊液組、芪藶強心溶液組各15只。假手術組、模型組給予空白人工腦脊液，陽性對照組給予αh-CRH，芪藶強心腦脊液組給予含芪藶強心膠囊成分的腦脊液，芪藶強心溶液組給予20 mg/ml的芪藶強心溶液，各組分別經側腦室連接微量注射泵以0.25 μL/h的速度連續給藥4周。

1.2.2 微量注射泵裝藥與植入 嚴格按照說明書將藥物裝入微量注射泵，保證微量注射泵無氣泡。將裝好藥物的微量注射泵植入大鼠體內，將大鼠麻醉后固定在水平桌面調整好立體定位儀，確定導管的安裝位置和解剖位置:前骨縫的交點處即前囟沿著中骨縫向前約1.5 mm，水平離中骨縫向右約1.5 mm的位置。使立體定位儀上方鋼針的針頭對準導管安裝的位置，在此位置打孔。將導管安裝在打好的孔內慢慢插入側腦室，大概在顱骨以下4.5 mm處。將導管用專用的膠水固定在顱骨上然后縫合顱骨皮膚，腹腔注射適量青霉素以消炎。術后的注意觀察大鼠的行為變化、手術部位有無感染。

1.2.3 大鼠血流動力學測定 經左側頸動脈插管，將充有肝素-生理鹽水的導管逆行插入左心室，連接壓力換能器，采用多導生理記錄儀記錄左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)和左室內壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)［4］。

1.2.4 大鼠血清腦利鈉肽(BNP)與血漿去甲腎上腺素(NE)的檢測 經查閱文獻與 BNP［5］、NE［6］在不同血液成分中的含量，采用檢測血清BNP與血漿NE法。采用腹主動脈取血，取出的血液分裝為A、B兩管，A管抗凝處理，B管不做處理，均放置室溫1 h，再4℃、3000 r/min離心15 min，分別取其上清于EP管，ELISA法檢測血清BNP與血漿NE水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，設立標準品的濃度，通過酶標儀擬合出標準曲線，檢測待測孔的OD值，分別得出樣本BNP與NE的含量。

1.2.5 下丘腦組織CRH mRNA與腦垂體組織ACTH mRNA表達的檢測 首先進行RNA提取，取組織于冰浴勻漿器中，加入1 ml Trizol研磨成勻漿，加入200 ul氯仿震蕩30 s，離心取上層轉移至另一離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，－20℃靜置2 h離心棄上清，加入1 ml 75%乙醇混勻，離心吸凈上清液晾干，加入20 ul DEPC處理的去離子水溶解沉淀。提取后對RNA純度與完整性進行檢測;反轉錄，Syber Green熒光定量PCR的檢測;進行實時熒光定量PCR結果分析，其中CRH mRNA與ACTH mRNA的引物信息分別為101 bp，上游:5'-ACCTCA ACAGAAGTCCCGC-3'，下游:5'-AAAGTTAGCCGCA GCCTG-3'和120 bp，上游:5'-ATTCTGCTACAGTC GCTCAGG-3'，下游:5'-AGGTTGCTTTCCGTGGTGA-3'，最后以GAPDH(GAPDH 120 bp，上游:5'-TGAA CGGGAAGCTCACTGG-3'，下游:5'-GCTTCACCACCT TCTTGATGTC-3')為內參照基因對比，得到目的基因的相對定量值(RQ值)。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據結果描述以均數±標準差(±s)表示，數據分析采用單因素方差分析法，組間兩兩比較，采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血流動力學變化

與假手術組比較，模型組大鼠LVEDP顯著升高，LVSP、±dp/dtmax明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性藥組、芪藶強心腦脊液組、芪藶強心溶液組可降低LVEDP水平，升高LVSP、±dp/dtmax水平，以陽性藥組和芪藶強心溶液組最為顯著(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 各組大鼠大鼠血流動力學變化比較(±s)

表1 各組大鼠大鼠血流動力學變化比較(±s)

注:與假手術組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01(下同)

組別 鼠數 LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/ms) －dp/dtmax(mmHg/ms) 空 白 對 照 組 15 112.231±12.29 3.911±2.49 4.313±0.52 3.868±0.41 假 手 術 組 15 104.877±19.72 5.125±1.47 4.011±0.83 3.463±0.77 模 型 組 15 90.301±18.66##9.994±2.45##2.320±0.59##2.100±0.34##陽 性 對 照 組 15 108.206±11.66＊＊4.837±1.30＊＊3.436±0.34＊＊3.104±0.31＊＊芪藶強心腦脊液組 15 103.500±11.27*6.109±1.86＊＊3.202±0.70＊＊3.215±0.48＊＊芪藶強心溶液組 15 107.389±11.10＊＊4.978±1.65＊＊3.510±0.44＊＊3.131±0.32＊＊

2.2 各組大鼠血清BNP、NE含量變化

與假手術組比較，模型組BNP、NE含量均顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，陽性藥組、芪藶強心腦脊液組、芪藶強心溶液組均可不同程度降低BNP、NE的含量(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 各組大鼠血清BNP與血漿NE含量的變化(±s)

表2 各組大鼠血清BNP與血漿NE含量的變化(±s)

注:與假手術組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數 BNP(pg/ml) NE(pg/ml)空 白 對 照 組9 6.564±1.08 245.375±56.26 假 手 術 組 9 7.818±1.83 243.317±34.14 模 型 組 9 11.162±2.38##331.777±36.80##陽 性 對 照 組 9 5.447±0.93＊＊249.940±22.59＊＊芪藶強心腦脊液組 9 8.825±2.00*251.300±27.46＊＊芪藶強心溶液組 9 7.249±1.36＊＊259.975±39.35＊＊

2.3 各組大鼠下丘腦CRH mRNA和腦垂體ACTH mRNA表達水平變化

與假手術組比較，模型組下丘腦CRH mRNA、腦垂體 ACTH mRNA表達水平顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，陽性藥組、芪藶強心腦脊液組、芪藶強心溶液組下丘腦CRH mRNA、腦垂體ACTH mRNA表達水平顯著下降(P＜0.01)

表3各組大鼠下丘腦CRH mRNA與垂體ACTH mRNA表達的變化(±s)

表3各組大鼠下丘腦CRH mRNA與垂體ACTH mRNA表達的變化(±s)

注:與假手術組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數CRH mRNA ACTH mRNA空 白 對 照 組6 0.978±0.30 1.130±0.22 假 手 術 組 6 0.946±0.13 1.331±0.46 模 型 組 6 3.133±0.39##5.415±0.70##陽 性 對 照 組 6 1.113±0.29＊＊2.771±0.98＊＊芪藶強心腦脊液組 6 1.222±0.17＊＊2.921±0.49＊＊芪藶強心溶液組 6 1.870±0.39＊＊3.160±0.75＊＊

3 討論

隨著中國醫學的發展，中醫藥在治療心衰方面的優勢日益凸顯。研究人員發現，芪藶強心膠囊組方中藥物的作用機理與現代醫學藥物有許多共同之處。藥理研究表明，附子具有擬交感作用，其有效成分烏頭堿有較強的強心作用［7］;人參可增加心肌細胞內cAMP的含量［8］。臨床實驗顯示，附子人參合用可使心衰患者血清BNP水平顯著降低［9］，因此芪藶強心膠囊在治療心衰時具有多靶點、多途徑、多環節的特點與優勢。

目前對心衰發病機制的研究顯示，在心衰過程中心功能會密切隨著心衰的發展及轉歸發生變化，且中樞神經系統的激活有著關鍵的作用，多種神經體液信號參與其中［10］。通過檢測心功能可以得到心臟的舒縮及射血情況，從而直接反映心衰。BNP對評定心衰的發生發展與預后有重要的意義，而心衰時NE在外周血的含量可作為反映交感神經興奮狀態的指標。下丘腦可分泌多種激素，其中較為重要的是CRH，其可誘導ACTH釋放入血，發揮重要的神經內分泌功能［11］。而過多的NE也可刺激下丘腦釋放更多的CRH，從而使ACTH能系統的活性升高，并會增強外周交感神經活動。本實驗運用微量注射泵連續將藥物泵入心衰大鼠側腦室，4周后與模型組比較，各給藥組大鼠均改善了心衰大鼠血流動力學，使血清BNP和血漿NE水平明顯降低，可明顯降低下丘腦CRH mRNA與腦垂體ACTH mRNA的表達。同時本實驗設定芪藶強心膠囊腦脊液組與芪藶強心溶液組，旨在說明芪藶強心膠囊中的某些成分以某種方式進入腦脊液，影響中樞的改變，而2組實驗數據也證明了這一點，其中的機制尚待進一步研究。

綜上所述，心衰過程中可能存在中樞神經系統的某些變化，影響心衰的發生發展和預后，經中樞給藥可以有效改善心衰，而中藥復方經特殊處理后用特殊的裝置注入側腦室，可延緩心衰的進展，改善心衰預后。這一研究對于臨床心衰的治療尤其是中藥復方芪藶強心膠囊對心衰的治療有著重要的指導意義，更加明確了心衰發病的中樞機制，為進一步心衰治療過程中尋找藥物治療新的靶點奠定了基礎，但其中的機制尚未完全明確，需要進一步的實驗研究。

［1］ Mommersteeg PM，Denollet J，SPertus JA，et al．Health status as a risk factor in cardiovascular disease:a systematic review of current evidence［J］．Am Heart J，2009，157(2):208-218．

［2］ 郭周威，宿宇坤，馬英，等．下丘腦室旁核氧化應激反應對心力衰竭時腎交感神經活動的影響［J］．中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(6):694-695．

［3］ 郭艷琳．下丘腦室旁核CRH神經元激活在慢性充血性心力衰竭中的交感興奮作用及機制研究［D］．太原:山西醫科大學，2011．

［4］ 黃平東，羅懿明，劉煜德，等．益氣溫陽活血利水藥對心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能和腦鈉肽的影響［J］．中西醫結合心腦血管病雜志，2008，6(5):538-539．

［5］ 張璐，白梅．芪藶強心膠囊對慢性心力衰竭患者心率變異性及血清腦利鈉肽的影響［J］．中國藥物與臨床，2013，7(13): 949-951．

［6］ 黃衍壽，冼紹祥．保心康治療氣陽虛型充血性心力衰竭的臨床研究［J］．中藥新藥與臨床藥理，2000，11(5):261-265．

［7］ 黃斌．芪藶強心膠囊對慢性收縮性心力衰竭患者心功能及血漿腦利鈉肽水平的影響［J］．中國實驗方劑學雜志，2010，16(16):191．

［8］ 王本祥，馬金凱，鄧文龍．現代中藥藥理學［M］．天津:天津科學技術出版社，1997:452-642．

［9］ Felder RB，Yu Y，Zhang ZH，et al．Pharmacological treatment for heart failure:a view from the brain［J］．Clin Pharmacol Ther，2009，86(2):216-220．

［10］ 譚浩，許民輝，周繼紅．CRH在中樞神經系統中的作用．國外醫學·生理、病理科學與臨床分冊，2002，22(6):615-617．

Effects of Chinese Herbal Medicine on Hemodynamics and Neuroendocrine Factors in Chronic Heart Failure Rats

MI Hong-ying1，2，TANG Si-wen2，JIA Chun-qin2，XU Deng-feng2，LANG Yan-song1，2，JIA Zhen-hua1，3，4△
(1．Hebei Medical University Shijiazhuang 050017，China;2．Yiling Medical Research Institute of Hebei Province，Shijaizhuang 050035，China;3．Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine/cardio-cerebral vascular network disease，Shijaizhuang 050035，China;4．IntegrativeMedicineInstituteof Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China)

Objective:To investigate the impact of the lateral ventricle administered by syringe pump on blood flow dynamics and neuroendocrine factors in chronic heart failure rats．Methods:To establish the acute myocardial infarctioninduced heart failure in rats by the left anterior descending coronary artery ligation．The rats were given Qiliqiangxin cerebrospinal fluid，Qiliqiangxin solution and CRH competitive inhibitor(αh-CRH)by the left ventricle for four weeks after modeling．Four weeks after administration，carotid artery was used to measure blood flow dynamics indicators in rats in each group，ELISA was used to detect serum brain natriuretic peptide(BNP)and norepinephrine(NE)，and PCR was used to detect the expression of the hypothalamus CRH mRNA and the pituitary ACTH mRNA．Results:Qiliqiangxin cerebrospinal fluid group，Qiliqiangxin solution group and positive drug group can improve blood flow dynamics，lower serum BNP，plasma NE，and reduce the expression of CRH mRNA and ACTH mRNA in rats with heart failure．Conclusion:Giving compound Chinese medicine by the lateral ventricles can improve hemodynamics，reduce blood levels of neuroendocrine factors，lower the expression of CRH mRNA and ACTH mRNA，contribute to the treatment of heart failure，and impact the change of the central nervous in heart failure rats．

Chronic congestive heart failure;Hypothalamic;Pituitary gland;Corticotropin-releasing hormone

R285.5

B

1006-3250(2015)10-1232-03

2015-03-12

國家自然科學基金資助項目-慢性充血性心力衰竭大鼠下丘腦室旁核CRH神經元激活相關機制及芪藶強心膠囊干預研究(81273978);國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目-基于微血管病變“營衛生化，交絡以通”(2012CB518606)

秘紅英(1987-)，女，在讀博士，從事中醫心血管疾病的臨床與研究。

賈振華(1975-)，男，醫學博士，博士研究生導師，從事中醫心血管疾病的臨床與研究，Tel:13331356155，E-mail:jiazhenhuayling@．cn。