補腎壯骨中藥復方對去卵巢骨質疏松癥大鼠骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達的影響*

王 劍，鄭洪新，張錦萍，劉 研，劉劍輝，宋光熠，劉瑞輝

(1．遼寧醫藥職業學院，沈陽 110101;2．遼寧省基礎醫學研究所，沈陽 110101; 3．遼寧中醫藥大學基礎醫學院，沈陽 110847)

補腎壯骨中藥復方對去卵巢骨質疏松癥大鼠骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達的影響*

王 劍1，2，鄭洪新3△，張錦萍1，劉 研1，劉劍輝1，宋光熠1，劉瑞輝1

(1．遼寧醫藥職業學院，沈陽 110101;2．遼寧省基礎醫學研究所，沈陽 110101; 3．遼寧中醫藥大學基礎醫學院，沈陽 110847)

目的:通過骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達，探討絕經后骨質疏松癥(PMOP)的發病機制以及補腎壯骨中藥復方的療效機理。方法:去卵巢復制骨質疏松癥大鼠模型按隨機數字表法分為正常組、模型組、假手術組、補腎組、鈣爾奇D組、骨疏康組，灌胃12周檢測骨密度、Dlx5 mRNA及蛋白表達。結果:與正常組比較，模型組股骨骨密度明顯降低，骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達明顯降低;與模型組比較，補腎組、骨疏康組股骨骨密度明顯升高，補腎組、骨疏康組骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達明顯上調。結論:PMOP的發病機制之一可能是骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達降低，補腎壯骨中藥復方可能通過上調骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達，有效防治絕經后骨質疏松癥。

絕經后骨質疏松癥;補腎壯骨中藥復方;Dlx5

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是臨床常見的慢性進行性疾病，主要表現為長期骨吸收超過骨形成，骨量逐漸減少，骨強度降低，骨結構破壞［1］，其確切發病機制尚不完全清楚，亦無特效防治方法。目前防治主要應用維生素D和鈣劑，但PMOP多因鈣沉積和流失所致，故單純補鈣未能產生良好的療效［2］。遠端缺失同源盒5 (distal-less homeobox 5，Dlx5)在調節哺乳動物成骨細胞分化中起關鍵作用［3］。本研究以骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達為效應指標，探討以中醫“腎主骨”理論為指導研制的補腎壯骨中藥復方的療效機理，為中醫藥防治PMOP提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

4～5月齡SPF級Wistar雌性大鼠100只(遼寧長生生物技術有限公司，合格證號0004179)，體質量(275±25)g。

1.2 藥品

補腎壯骨中藥復方(鹿茸、淫羊藿、牡蠣)、鈣爾奇D(Wyeth)、骨疏康顆粒(遼寧康辰藥業有限公司)。

1.3 主要儀器

XR-36型雙能X線骨密度儀(NORLAND)、ABI 7500型定量PCR儀、電泳儀(BIO-RAD，PowerPac200)等。

1.4 主要試劑

TRIZOL(康為世紀)、實時定量RT-PCR試劑盒(TaKaRa)、羊抗Dlx5多克隆抗體(santa cruz)、堿性磷酸酶標記的兔抗羊IgG(北京中山生物公司)等。

2 方法

2.1 分組

預實驗7只，余者按隨機數字表法分為正常組(A)12只，模型組(B)12只，假手術組(C)12只，補腎組(D)20只，鈣爾奇D組(E)18只，骨疏康組(F)19只。

2.2 造模

正常組除外，余者2%戊巴比妥鈉腹腔注射(35 mg/kg)麻醉，手術從腹部切除雙側卵巢，假手術組只切開切口而不切除卵巢。

2.3 給藥

大鼠等效劑量按成人6.3倍計算，給藥容積0.5 ml/100 g。A、B、C 3組給予生理鹽水，D組給予補腎壯骨中藥復方(1.139 g·kg－1·d－1)，E組給予鈣爾奇D(0.126 g鈣·kg－1·d－1)，F組給予骨疏康顆粒(2.1 g·kg－1·d－1)。術后7 d開始每日灌胃1次，連續12周。

2.4 指標檢測

2.4.1 骨密度(BMD) 取右后肢全股骨剔除筋肉，外包生理鹽水潤濕的醫用紗布、外裹錫紙，－20℃冰箱凍存待測。應用XR-36型雙能X線骨密度儀檢測大鼠離體股骨骨密度，附帶軟件進行數據分析。

2.4.2 Dlx5 mRNA表達 取左后肢股骨頭剔除筋肉夾碎，取一半放入裝有1 ml Trizol的EP管內，－70℃冰箱凍存待測。檢測:①抽提總RNA;②測吸光度，OD260/OD280約為2.0，證明為RNA純品;③反轉錄，實時定量PCR擴增。北京華大基因公司合成引物。Dlx5上游引物:5'-GCCACCGATTCTG ACTACTA-3'，下游引物:5'-CGTTCACGCTGTG ATACTG-3'，擴增產物長度121 bp。內參GAPDH上游引物:5'-CGT ATC GGA CGC CTG GTT-3'，下游引物:5'-CGT GGG TAG AGT CAT ACT GGA AC-3'，擴增產物長度 124 bp;④計算 Ct值，以 2－△△Ct(Livak)法對Dlx5 mRNA表達相對定量。

2.4.3 Dlx5蛋白表達 取夾碎股骨頭的另一半放入空白 EP管內，－70℃冰箱凍存待測。Western Blot步驟:提取總蛋白、蛋白定量、SDSPAGE凝膠電泳、轉印、抗體孵育、顯色。計算:數碼凝膠成像，分析灰度值，以Dlx5條帶灰度值/內參GAPDH條帶灰度值來表示其相對蛋白表達。

2.5 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，數據間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

灌胃期間大鼠死亡5只，取材共88只。

3.1 股骨骨密度

表1顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P ＜0.01);與模型組比較，補腎組、骨疏康組明顯升高(P＜0.05)，鈣爾奇D組雖有升高趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠離體股骨骨密度(±s)

表1 各組大鼠離體股骨骨密度(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05

組別 鼠數 股骨骨密度(g/cm2)正 常 組12 0.1375±0.0063 模 型 組 12 0.1259±0.0060＊＊假 手 術 組 11 0.1331±0.0109△補 腎 組 19 0.1327±0.0095△鈣 爾 奇 D 組 17 0.1286±0.0058 骨 疏 康 組 17 0.1321±0.0057△

3.2 骨組織Dlx5 mRNA表達

表2顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P ＜0.01);與模型組比較，補腎組(P＜0.01)、骨疏康組(P＜0.05)明顯上調，鈣爾奇D組雖有升高趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05);與鈣爾奇D組比較，補腎組明顯升高(P＜0.05)。

表2 各組大鼠骨組織Dlx5 mRNA表達(±s)

表2 各組大鼠骨組織Dlx5 mRNA表達(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P ＜0.01;與鈣爾奇D組比較:★P＜0.05

組別 鼠數 Dlx5(mRNA)正 常 組10 1.012±0.184 模 型 組 10 0.255±0.029＊＊假 手 術 組 10 1.027±0.132△△補 腎 組 10 0.605±0.028△△★鈣 爾 奇 D組 10 0.422±0.064 骨 疏 康 組 10 0.486±0.038△

3.3 骨組織Dlx5蛋白表達

圖1表3顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，補腎組(P＜0.01)、骨疏康組(P＜0.05)明顯上調，鈣爾奇D組雖有升高趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05);與鈣爾奇D組、骨疏康組比較，補腎組明顯升高(P＜0.01)。

圖1 骨組織Dlx5、GAPDH蛋白Western Blot條帶

表3 各組大鼠骨組織Dlx5蛋白表達(±s)

表3 各組大鼠骨組織Dlx5蛋白表達(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P ＜0.01;與鈣爾奇D組比較:★★P＜0.01;與骨疏康組比較:※※P＜0.01

組別 鼠數 Dlx5(蛋白)正 常 組10 1.082±0.064 模 型 組 10 0.734±0.023＊＊假 手 術 組 10 1.067±0.043△△補 腎 組 10 0.943±0.036△△★★※※鈣 爾 奇 D組 10 0.749±0.019 骨 疏 康 組 10 0.803±0.029△

4 討論

現代醫學研究表明，PMOP是一種與衰老有關的常見病，主因之一是雌激素缺乏，雌激素能促進早期成骨細胞分化并抑制破骨細胞活性。婦女絕經后雌激素缺乏，破骨增加、成骨減少，打破了二者之間的平衡，導致骨量減少、微結構破壞、強度減低、脆性增加且易于骨折，從而引起骨痛、骨骼變形等，最終導致PMOP［4-5］。西藥治療有雌激素、氟化物、鈣劑等，主要功效是抑制破骨、促進成骨，但這些藥物毒性及不良反應普遍存在［5-6］，為此我們更希望選擇一種安全、有效的藥物來改善病情，所以有著確切療效的中藥制劑日益受到研究者的青睞［7］。

中醫古籍中雖未記載“骨質疏松癥”，但頗多論述骨病的文獻。如《素問·長刺節論》:“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”《中藏經·論骨痹第三十八》:“骨痹者，乃嗜欲不節，傷于腎也。”《千金要方·骨極》:“骨極者，主腎也，腎應骨，骨與腎合……若腎病則骨極，牙齒苦痛，手足疼，不能久立，屈伸不利，身痹腦髓酸。”《扁鵲心書·骨縮》:“此由腎氣虛憊，腎主骨，腎水既涸，則諸骨皆枯，漸至短縮。”從上述論述可以看出，“骨痹”、“骨極”、“骨縮病”均與骨質疏松癥的表現類似，病機均責之于腎。腎主藏精，精生髓，髓居骨中充養之，若腎虛精虧無以生髓養骨則發骨質疏松。《素問·上古天真論》:“女子七歲，腎氣盛，齒更發長;二七而天癸至……月事以時下……三七腎氣平均，故真牙生而長極;四七筋骨堅……七七……天癸竭，地道不通。”亦說明腎精盛衰關系到骨的強勁脆弱、腎精充盛、髓足骨強;女子七七天癸竭，腎虛精虧，髓減骨枯，即發絕經后骨質疏松癥。因此，腎虛精虧、髓減骨枯是PMOP的根本病機，補腎填精、益髓壯骨法是防治該病的根本大法。

Dlx5屬于同源異型盒(homeobox，Hox)基因家族，含3個外顯子和2個內含子［8］。Simeone等在鼠骨中發現，Dlx5是一種在調節哺乳動物成骨細胞分化中起關鍵作用的轉錄因子［3，9］。人的 Dlx5定位于染色體7q22位點，接近Hoxa簇，且人與鼠Dlx有高度同源性［8］。在骨鈣素、骨涎蛋白和I型膠原的調控序列上均存在Dlx5的結合位點［8-10］。Dlx5與之結合，促進其基因轉錄，從而促進骨基質的礦化［3］。Dlx5亦可增強Runx2基因P1啟動子的活性，從而促進成骨細胞的分化［11］。新近發現，Dlx5介導BMP2誘導的 Runx2表達、介導BMP2調控Osterix的功能，從而促進成骨細胞分化和成熟［8，12］。綜上所述，Dlx5作為成骨分化的關鍵轉錄因子能夠調控成骨細胞分化及成骨特異基因表達，在骨質疏松癥的防治中具有重大意義。

筆者前期實驗研究表明［13］，糖皮質激素性骨質疏松癥的發病機制可能與骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達降低有關;補腎中藥復方可上調其表達，有效防治該病。但筆者尚未查閱到Dlx5在絕經后骨質疏松癥的發病機制以及中醫藥防治該病方面的相關文獻報道。本研究在中醫“腎藏精生髓主骨”理論的指導下，依據PMOP腎虛精虧、髓減骨枯的根本病機，建立補腎填精、益髓壯骨法，研制補腎壯骨中藥復方，以骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達為效應指標，探討PMOP的發病機制以及補腎壯骨中藥復方的療效機理。方中以鹿茸(遼寧清原鹿場密生茸毛未骨化的雄馬鹿幼角，應用凍干技術制備鹿茸凍干粉，其所含的多種生長因子均可保持良好活性)為君藥，生精補髓、養血益陽、強筋健骨(《本草綱目》);以淫羊藿(水提法制備淫羊藿提取物微粉)為臣藥，補腎虛(《醫學入門》)、益精氣(《本草綱目》)、堅筋骨(《別錄》);佐以牡蠣(長山島大連灣牡蠣貝殼，應用納米技術制備納米鈣微粒，更有利于其所含鈣的吸收)補腎(《海藥本草》)、強骨節(《神農本草經》)、滋陰潛陽，三者混合制成補腎壯骨中藥復方，全方共奏補腎填精、益髓壯骨之功。本實驗選用骨質疏松癥臨床治療常用西藥鈣爾奇D(主要功效是促進腸道對鈣、磷的吸收和骨正常鈣化)和首個中藥復方骨疏康顆粒(功能補腎益氣、活血壯骨)作為對照藥，與本研究補腎壯骨中藥復方的療效相比較。本實驗采用切除雌性大鼠雙側卵巢的經典方法復制PMOP動物模型［14］，結果顯示模型組骨密度比正常組顯著降低，說明本實驗PMOP動物模型復制成功。模型組骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達比正常組顯著降低，可能通過影響骨鈣素、骨涎蛋白、I型膠原、Runx2基因的表達和Osterix的功能抑制成骨細胞分化、成熟和骨形成，導致骨質疏松。與模型組比較，補腎壯骨中藥復方明顯上調骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達，可能通過促進骨鈣素、骨涎蛋白、I型膠原、Runx2基因的表達和調控Osterix的功能而促進成骨細胞分化、成熟和骨形成，從而使骨密度顯著升高，較之骨疏康顆粒療效更優;鈣爾奇D雖然也使骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達和骨密度有所升高，但均無統計學意義。因此，絕經后骨質疏松癥的發病機制之一可能是骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達降低;補腎壯骨中藥復方可顯著上調骨組織Dlx5 mRNA及蛋白表達，有效防治該病，療效較之骨疏康顆粒及鈣爾奇D更優。故臨床防治絕經后骨質疏松癥可選用補腎填精、益髓壯骨法。

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Effect of Reinforcing Kidney to Strengthen Bone Traditional Chinese Medicine Compound on mRNA and Protein Expression of Dlx5 in Bone Tissues of Ovariectomized Osteoporosis Rats

WANG Jian1，2，ZHENG Hong-xin3△，ZHANG Jin-ping1，LIU Yan1，LIU Jian-hui1，SONG Guang-yi1，LIU Rui-hui1
(1．Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China;2．Liaoning Institute of Basic Medicine，Shenyang 110101，China;3．Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China)

Objective:To discuss the pathogenesis of Postmenopausal Osteoporosis(PMOP)and the therapeutic effect and mechanism of reinforcing kidney to strengthen bone traditional Chinese medicine compound by mRNA and protein expression of Dlx5 in bone tissues．Methods:We established the osteoporosis rat models by ovariotomy．We divided all the rats into normal group，model group，sham-operated group，reinforcing kidney group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group．After 12 weeks of gavage，we detected bone mineral density，mRNA and protein expression of Dlx5．Results:①Compared with normal group，femur bone mineral density of model group decreased significantly，mRNA and protein expression of Dlx5 decreased significantly in bone tissues．②Compared with model group，femur bone mineral density of reinforcing kidney group and GUSHUKANG group increased significantly;mRNA and protein expression of Dlx5 of reinforcing kidney group and GUSHUKANG group up-regulated significantly in bone tissues．Conclusions:Maybe it is one aspect of the pathogenesis of PMOP that mRNA and protein expression of Dlx5 decreases in bone tissues;Reinforcing kidney to strengthen bone traditional Chinese medicine compound can prevent and treat PMOP by up-regulating mRNA and protein expression of Dlx5 in bone tissues．

Postmenopausal Osteoporosis(PMOP);Reinforcing kidney to strengthen bone traditional Chinese medicine compound;Distal-less homeobox 5(Dlx5)

R285．5

B

1006-3250(2015)10-1238-03

2015-02-23

遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2011247)-補腎益髓法對絕經后骨質疏松癥Runx2相關基因表達的級聯調控作用

王 劍(1978-)，女，遼寧沈陽人，副教授，醫學博士，從事中醫藥與分子生物學相關研究。

鄭洪新，教授，博士研究生導師，從事中醫病因病機理論研究，Tel:13604076118，E-mail:zhenghx2002@126．com。