CAG的中醫證型與幽門螺旋桿菌、IL-10的相關性研究*

劉長明，馮全林，張劍治，胡漪璐，楊 悌，張 穎

(南京中醫藥大學昆山附屬醫院檢驗科，江蘇昆山 215300)

CAG的中醫證型與幽門螺旋桿菌、IL-10的相關性研究*

劉長明，馮全林，張劍治，胡漪璐，楊 悌，張 穎△

(南京中醫藥大學昆山附屬醫院檢驗科，江蘇昆山 215300)

目的:探討慢性萎縮性胃炎(CAG)患者的證型與幽門螺旋桿菌(Hp)感染、IL-10的基因多態性及水平的相關性。方法:招募156例CAG患者及150名無Hp感染的健康人，采用C13呼氣法及金標法檢測Hp、ELISA檢測IL-10含量、PCR-RFLP分析IL-10多態性。結果:CAG患者證型以脾胃虛弱(35.44%)與胃陰不足(27.22%)為主。CAG患者Hp的感染率為49.37%，以脾胃濕熱(69.23%)、肝胃不和(68.42%)及瘀血阻絡組(57.14%)較高，與其他組比較差異有統計學意義。脾胃濕熱組(55.57± 12.31pg/ml)及肝胃不和組IL-10水平(48.38±13.91pg/ml)顯著高于對照組(38.21±5.35 pg/ml)。IL-10基因多態性在病例及對照組之間分布比較差異無統計學意義。結論:Hp感染與CAG患者外周血的IL-10水平相關，二者均與CAG證型相關，提示中醫治療CAG時應關注患者的Hp感染及患者的IL-10水平。

慢性萎縮性胃炎;證型;Hp感染;IL-10;基因多態性

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis， CAG)是由多種因素導致的胃黏膜反復損傷引起的胃黏膜上皮和腺體萎縮的消化系疾病，因其多伴有腸上皮化生和不典型增生而與胃癌發生關系密切［1］。CAG的病因尚不明確，現有研究普遍認為幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染、患者的免疫反應及遺傳因素是其主要致病因素。現代醫學治療CAG往往療效欠佳，而中醫對CAG進行辨證施治獲得良好治療效果。研究顯示，CAG的中醫證型與Hp感染相關［2-3］，然而對Hp感染后患者的免疫狀態及遺傳背景鮮有報道。白細胞介素10(IL-10)是重要的免疫調節細胞因子，處于機體免疫調節的中心環節。本研究擬采用分子生物學、免疫學的方法分析患者的IL-10基因多態性及Hp感染，探討其與CAG中醫證型的關系，為中醫治療CAG提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

招募來自2012年1月至2013年12月期間因胃部不適來昆山市中醫醫院就診并經病理確認為CAG患者共計156例。其中男性93例，女性63例，平均年齡(51±15.23)歲。招募體檢正常者150例，平均年齡(52±16.35)歲，其中年齡、性別與CAG組比較差異無統計學意義。對照組經C13呼氣實驗及金標法檢驗確認無Hp感染。所有病例經脾胃病科診斷并辨證分型(脾胃虛弱、肝胃不和、脾胃濕熱、胃陰不足、瘀血阻絡［3-4］)。

1.2 試劑

C13呼氣實驗試劑盒為Isodiagnostika公司產品;金標法檢測血清Hp抗體試劑盒為北京康美天鴻生物科技有限公司產品;IL-10 ELISA檢測試劑盒為上海森雄科技實業有限公司產品。DNA提取試劑盒為美國Omega公司產品;RNA酶及蛋白酶K購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA聚合酶由大連Takara公司提供;限制性內切酶RsaⅠ及SspⅠ均為Fermentas Life Sciences公司產品;BslⅠ為NEB公司產品;PCR擴增所用引物由上海Invitrogen有限公司合成。

1.3 Hp感染檢測

患者及正常對照組經C13呼氣實驗及金標法檢測Hp感染，二者同時確認為Hp感染陽性。正常對照組經C13呼氣實驗及金標法檢測，同時為陰性者納入本研究。試驗步驟均依說明書按步驟完成。

1.4 IL-10血漿含量檢測

采集患者及健康受試者全血分離血漿。采用ELISA法對患者及健康受試者血漿中的IL-10含量進行檢測，實驗操作步驟依據產品說明書進行。

1.5 CAG診斷及中醫辨證分型

臨床患者行胃鏡活檢，經病理診斷為CAG的患者接受中醫治療，由脾胃病科中醫醫師依臨床診斷進行中醫辨證分型。

1.6 基因組DNA提取及IL-10基因分型

1.6.1 DNA提取 取EDTA-K2抗凝全血，分離血漿后加入3 ml紅細胞裂解液，混勻震蕩5 min，800 g離心5 min沉淀白細胞;然后進行白細胞基因組DNA提取，實驗步驟依照試劑盒說明書進行。

1.6.2 IL-10基因分型 采用聚合酶鏈反應(PCR)及限制性片段長度多態性(RFLP)技術分析IL-10(IL-10-1082、-819及-592位點)的基因多態性。經PCR擴增后產物分別用BslⅠ(IL-10-1082)、SspⅠ(IL-10-819)及RsaⅠ(IL-10-592)限制性內切酶進行酶切，酶切的方法同先前發表的論文［5］，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分型。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，計數資料用χ2檢驗，并通過比數比(OR)進行相關性分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗統計差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAG患者的中醫證候分型

表2顯示，患者以脾胃虛弱(56例，35.44%)與胃陰不足(43例，27.22%)較多，其他證型的例數排序分別為脾胃濕熱、肝胃不和、瘀血阻絡。

表1 PCR-RFLP法分析IL-10啟動子區基因多態性

2.2 CAG患者Hp感染情況

CAG患者中有76例(49.37%)檢出Hp感染，以脾胃濕熱組(69.23%)、肝胃不和組(68.42%)及瘀血阻絡組(57.14%)感染率較高。脾胃濕熱組Hp感染率最高，與脾胃虛弱組(χ2=7.17，P= 0.007)及胃陰不足組(χ2=4.86，P=0.027)比較差異有統計學意義;肝胃不和組的Hp感染率其次，顯著高于脾胃虛弱組(χ2=5.47，P=0.019)，其余各組間比較差異無統計學意義。

2.3 正常對照組及CAG患者組血清IL-10含量

表3顯示，正常對照組外周血中IL-10濃度顯著低于脾胃濕熱組及肝胃不和組(P＜0.05)，其余各組亦均比正常對照組高，但差異無統計學意義。

2.4 CAG患者及正常對照組IL-10基因多態性分析

表4顯示，正常對照組3個位點的基因型分布頻率符合哈溫-伯格平衡，具有群體代表性。3個基因多態性位點的基因型分布頻率在2組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與野生基因型比較差異無統計學意義。

表2 CAG患者中醫辨證分型及Hp感染情況［例(%)］

表3 正常對照組及CAG患者組血清IL-10含量比較(±s)

表3 正常對照組及CAG患者組血清IL-10含量比較(±s)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05;與CAG Hp未感染組比較:#P＜0.05

?

表4 IL-10各基因型分布與CAG相對風險分析［例(%)］

3 討論

CAG被普遍認為是胃癌的癌前病變，周阿高等［6］對近10年來文獻總結顯示，中醫治療CAG療效較好。本研究結果顯示，CAG證型以脾胃虛弱與胃陰不足為主，其中脾胃濕熱、肝胃不和證型患者中的Hp感染率相對較高，且IL-10呈現較高水平。然而IL-10啟動子區基因多態性在對照組及CAG組分布比較差異無統計學意義。

本研究觀測到CAG以脾胃虛弱證型為多，與丁成華等報道一致［4］。本研究各證型的排序與魏玉霞的分析結果相一致［7］。該研究顯示，證型占比順序依次為脾胃氣虛、胃陰虧虛、脾胃濕熱、肝胃不和、脾胃虛寒、肝郁脾虛、瘀阻胃絡、氣陰兩虛。Hp菌體表面的脂多糖、脲素酶及細胞毒素是引起患者免疫反應的主要因素，Hp感染引起的患者免疫反應與胃部疾病的進展相關［8］。中醫治療CAG以辨證論治為主，但仍然強調“審癥求因”。一般說來，Hp屬于中醫學“邪氣”、“熱毒”范疇。外感邪氣經口侵入體內，犯于脾胃，脾胃功能失常，引起胃脘部脹悶、疼痛、納差等。外邪侵入機體后易于化熱，因此本病患者多有胃熱表現。另一方面，“正氣存內，邪不可干”、“邪之所湊，其氣必虛”。脾胃虧虛是Hp能侵入體內引起疾病的前提之一，且CAG病程一般較長，日久則正氣漸虛而致脾胃虛弱。Hp感染與CAG患者證型的因果關系較為復雜。本研究對156例患者觀察顯示，Hp感染率為49.37%，在各證型中分布依次為脾胃濕熱、肝胃不和、瘀血阻絡、胃陰不足、脾胃虛弱。此與劉興山等［9］對287例CAG患者研究發現，Hp感染與CAG證型分布(胃絡瘀血＞脾胃濕熱＞肝胃不和＞脾胃虛弱＞胃陰不足)結果相近。但該研究報道，Hp的總體感染率為69.34%，可能因Hp感染率地區差異所致。此外，王立等［10］對1366例Hp感染胃部疾病患者中證型依次為脾胃濕熱型＞胃絡瘀血型＞肝胃不和型＞脾胃虛弱型;陳飛松等［11］報道，Hp感染患者證型依次為脾胃濕熱＞肝胃不和＞脾胃虛弱＞胃陰不足。雖上述研究并非針對CAG患者，但與本研究的結果相近。上述研究的證型分布除地區間Hp感染率差異外，近年來因經濟條件改善、患者積極治療亦是重要原因。

IL-10是由輔助性T細胞亞群Th2細胞分泌的一種抑制Th1細胞功能、抑制炎癥的細胞因子，其處于免疫調節的中心環節，具有免疫抑制和免疫刺激的雙向作用［12］。本研究顯示，在CAG患者中IL-10呈現升高的趨勢，以脾胃濕熱組及肝胃不和組為主。此外本研究還顯示，CAG患者并發Hp感染較未感染患者的IL-10更高，與張洪芳等的報道相一致［13］。但IL-10的表達與中醫CAG證型的相關性迄今未見報道，本研究的結果提示IL-10與Hp感染及患者的證型相關。

近年來研究顯示，IL-10基因啟動子的基因多態性與IL-10的表達相關，且與胃部疾病的發生相關。課題組前期研究顯示，IL-10啟動子區IL-10-1082位點的GA基因型與胃癌的發生相關［5］。但本研究結果顯示，IL-10基因啟動子區多態性與CAG無相關性，此結果國外的研究中亦有報道［14-15］。但由于本研究所納入的研究樣本數量還相對較少，此結論有待于在中國人群中進行大樣本的研究來證實。

綜上所述，本研究結果提示Hp的感染與患者外周血的IL-10水平相關，且二者均與中醫CAG的證型相關，提示中醫治療CAG時應關注患者的Hp感染及患者的IL-10水平。

［1］ The Eurohepygast Study Group．Risk factors for atrophic chronic gastritis in a European population:results of the Eurothepygast study［J］．Gut，2002，50:779-785．

［2］ 中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會．慢性胃炎的中西醫結合診治方案(草案)［C］．重慶:中國中西醫結合雜志，2005，25(2):172-175．

［3］ 中華中醫藥學會脾胃病分會．慢性萎縮性胃炎中醫診療共識意見(2009，深圳)［C］．中國中西醫結合消化雜志，2009，18(5):345-348．

［4］ 丁成華，李晶晶，方芳，等．慢性萎縮性胃炎中醫病機與證候分布規律研究［J］．中華中醫藥雜志，2011，26(3):582-586．

［5］ 張穎，何幫順，潘玉琴，等．白細胞介素10基因啟動子區多態性與胃癌易感性的關系研究［J］．南京醫科大學學報，2010，30(9):1295-1300．

［6］ 周阿高，李琰．中醫藥治療慢性萎縮性胃炎文獻薈萃分析［J］．中國實驗方劑學雜志，2010，16(1):120-123．

［7］ 魏玉霞．慢性萎縮性胃炎近10年中醫文獻研究［D］．北京:北京中醫藥大學，2012:37．

［8］ Fox J G，Wang T C．Inflammation，atrophy，and gastric cancer ［J］．J Clin Invest，2007，117(1):60-69．

［9］ 劉興山，郝筱倩，楊斌．中醫舌診、辨證在幽門螺旋桿菌相關慢性萎縮性胃炎診治中的意義［J］．中醫研究，2010，23 (1):32-34．

［10］ 王立，趙榮萊，陳正松．慢性胃炎、消化性潰瘍中醫證型與Hp的關系［J］．中國中西醫結合雜志，1995，3(1):27-28．

［11］ 陳飛松，劉晉生．慢性胃病幽門彎曲桿菌感染和中醫證型關系的探討［J］．北京中醫，1990(4):14-16．

［12］ Chen YX，Man K，Ling GS，et al．A crucial role for dendritic cell DC IL-10 in inhibiting successful DC-based immunotherapy superior antitumor immunity against hepatocellular carcinoma evoked by DC devoid of IL-10［J］．J Immunol，2007，179(9): 6009-6015．

［13］ 張洪芳，范鐘麟，王學紅．慢性萎縮性胃炎患者IL-10、IL-12的表達水平及其臨床意義［J］．青海醫學院學報，2007，28 (4):252-254．

［14］ Con SA，ConWong R，ConChin GR，et al．Serum pepsinogen levels，Helicobacter pylori Cag A Status，and cytokine gene polymorphisms associated with gastric premalignant lesions in Costa Rica［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2007，16 (12):2631-2636．

［15］ Seno H，Satoh K，Tsuji S，et al．Novel interleukin-4 and interleukin-1 receptor antagonist gene variations associated with non-cardia gastric cancer in Japan:comprehensive analysis of 207 polymorphisms of 11 cytokine genes［J］．J Gastroenterol Hepatol，2007，22(5):729-737．

Study on the Association between the Distribution of Syndrome Type of Patients with Chronic Atrophic Gastritis(CAG)and Helicobacter pylori and IL-10

LIU Chang-ming，FENG Quan-lin，ZHANG Jian-zhi，HU Yi-lu，YANG Di，ZHANG Ying△
(Department of Laboratory Medicine，Kunshan Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Kunshan，Jiangsu 215300，China)

Objective:To explore the association between the distribution of syndrome type of patients with chronic atrophic gastritis(CAG)and Helicobacter pylori(Hp)infection and the level and polymorphisms of IL-10．Methods:156 CAG patients and 150 health people without Hp infection were enrolled;The Hp infection was tested by13C-Urea Breath Test and colloidal gold-labeled assay(GICA);The level of IL-10 was measured by Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA);Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism(PCR-RFLP)was applied to genotype the polymorphisms of IL-10．Results:In the CAG patient，the number of the syndrome type of weakness of spleen and stomach，deficiency of stomach-yin were majority．The Hp infection ratio of CAG was 49.37%，and it was higher in the patients with syndrome type of damp-heat in spleen and stomach(69.23%)，disharmony between liver and stomach (68.42%)and blood stasis of the collaterals(57.14%)，and there was significant difference between them．The IL-10 level in the patients with type of syndrome of damp-heat in spleen and stomach(55.57±12.31pg/ml)and disharmony between liver and stomach(48.38±13.91pg/ml)was significant higher than that in health controls(38.21±5.35pg/ ml)．There was no difference of the distribution of IL-10 genotypes between patients and health controls．Conclusion:The Hp infection was related with IL-10 level in the CAG patents．the Hp infection and IL-10 level were associated with the syndrome type of CAG patients．It is indicated that Hp infection and level IL-10 should be considered in the treatment for the CAG patients according to the syndrome type．

Chronic Atrophic Gastritis(CAG);Syndrome types;Helicobacter pylori infection;IL-10; polymorphism

R573．3+2

B

1006-3250(2015)10-1271-04

2015-02-18

江蘇省中醫藥局科技項目(LZ13157，YB2015105);昆山市科技發展項目(ks1361，ks1259)，(LZ13157，ks1361):胃炎I號方辨證治療CAG的機制探討與療效觀察(ks1259):幽門螺旋桿菌致病島的基因變異與Th1型細胞因子的遺傳多樣性的交互作用致胃癌發生風險研究;幽門螺旋桿菌基因分型與胃部疾病證型及藥物敏感性的相關性研究(YB2015105)

劉長明，男，江蘇金湖人，副主任技師，醫學學士，從事醫學檢驗的臨床與研究。

張 穎，女，主任技師，碩士研究生導師，E-mail:kszyy_zy@126．com。