針刀干預對膝骨關節(jié)炎兔軟骨細胞整合素β1表達的長期影響*

張麗萍，郭長青

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

針刀干預對膝骨關節(jié)炎兔軟骨細胞整合素β1表達的長期影響*

張麗萍，郭長青△

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

目的:探討針刀對KOA的長期作用。方法:按隨機數(shù)字表法將48只兔分為空白組、模型組、針刀組、電針組各12只，后3組用伸直位固定制動法造模，治療后取材檢測軟骨整合素β1mRNA、蛋白。結果:模型組整合素mRNA水平降低，較空白組比較差異有統(tǒng)計學意義;針刀組整合素mRNA水平上升，較空白組比較差異無統(tǒng)計學意義;電針組整合素蛋白水平上升，較空白組差異顯著。結論:針刀可上調整合素β1基因和蛋白水平，長期觀察發(fā)現(xiàn)其含量接近正常，即針刀的長期療效是顯著的。

膝骨關節(jié)炎;針刀;整合素β1;長期影響

膝骨關節(jié)炎(knee Osteoarthritis，KOA)是一種臨床常見的慢性關節(jié)疾病，其主要病變是膝關節(jié)軟骨退行性改變和繼發(fā)性骨質增生，表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、畸形和功能障礙［1］。膝骨關節(jié)炎的發(fā)病機制目前尚未完全明確，部分學者認為其發(fā)病途徑之一有可能是膝關節(jié)周圍軟組織損傷引起膝關節(jié)力學平衡失調后，力學信號刺激軟骨細胞膜上的信號傳導因子整合素，啟動軟骨細胞內一系列的生化反應，調控細胞內膠原、基質金屬蛋白酶的基因表達，最終造成軟骨基質的病變。因此，整合素在軟骨細胞內的基因與蛋白的表達和軟骨基質的損傷與修復有著密切的關系。針刀松解法在治療經(jīng)筋疾病方面已經(jīng)形成了一套比較完整、規(guī)范的操作技術，且臨床上我們應用針刀松解法治療膝骨關節(jié)炎取得了良好的療效。前期的動物實驗已經(jīng)初步研究了針刀通過松解膝關節(jié)周圍軟組織達到修復軟骨的短期作用機制。本實驗以膝骨關節(jié)炎兔為研究對象，通過針刀松解法治療后，觀察膝關節(jié)軟骨中整合素β1基因及蛋白表達水平的長期變化，研究針刀松解法對膝骨關節(jié)炎兔軟骨細胞內整合素β1基因、蛋白表達的長期影響，探討針刀松解法治療膝骨關節(jié)炎的長期療效。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

6月齡新西蘭家兔48只，體質量(2.25±0.25) kg，由北京市金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司提供，在北京軍區(qū)總醫(yī)院骨科研究所動物實驗室喂養(yǎng)。按隨機數(shù)字表將家兔分為空白組、模型組、電針組、針刀組各12只，除空白組外其余3組均參加造模。

1.2 主要設備和試劑

直徑0.40 mm、長40 mm的漢章牌一次性針刀，直徑0.25 mm、長25 mm的環(huán)球牌一次性無菌針灸針。LH202H型HANS穴位神經(jīng)刺激儀。Real-Time PCR儀(型號IQ5，BIO-RAD)，美國。超微量核酸蛋白測定儀(型號ND2000C，Thermo)，美國。動物組織總RNA提取試劑盒、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix(SYBR Green)PCR試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。一抗Integrin-β1為鼠單抗(貨號MAB1981，美國MILLIPORE公司)，二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)，HRP(貨號S001，北京天德悅生物科技有限責任公司)。

1.3 膝骨關節(jié)炎模型復制

采用改良后Videman法［2］即左后肢伸直位固定制動法:除空白組外，另3組造模塊動物于造模前禁食10～16 h，以3%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉，剪去左后肢踝關節(jié)以上兔毛，牽拉使其處于完全伸直位，樹脂繃帶經(jīng)65℃ ～85℃熱水浸泡軟化后，從腹股溝到趾頭固定(膝關節(jié)伸直180°，踝關節(jié)背屈60°)，留出足趾觀察血供，樹脂外以石膏固定，繼用醫(yī)用紗布包裹，加以制動并保持其透氣性，以防止兔撕咬，共制動6周［3］。如足趾有壞死、發(fā)黑、浮腫等情況出現(xiàn)，應立刻拆除石膏、樹脂，待腫脹消退后再重新固定。若樹脂松動或脫落應及時重新固定。在整個造模過程中，若出現(xiàn)足底潰爛、咬傷、骨折、皮膚感染、腹瀉等情況均予以剔除。

1.4 干預方法

空白組不做任何處理;模型組造模后不做干預治療;電針組造模后1周，以韓氏穴位神經(jīng)刺激儀進行電針刺激治療，分別連接內膝眼和外膝眼、陽陵泉和陰陵泉。波形疏密波，頻率2/100 Hz，強度3 mA，每次20 min，以動物肢體微顫且無嘶叫為度。隔天治療1次，1周治療3次，共治療3周。

針刀組造模后1周，在兔膝關節(jié)針刀進針部位，以龍膽紫定位，常規(guī)備皮、消毒，然后刺入針刀，出針并按壓片刻止血。每周1次，共3次，共治療3周。各進針點具體操作如下:①內、外側副韌帶進針點操作:針刀于韌帶中點前緣進針，刀口線與韌帶方向平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，向韌帶起、止點方向分別松解，出刀并加壓片刻;②髕韌帶進針點操作:刀口線與髕韌帶縱軸平行，刀體和髕韌帶皮膚切面垂直。快速剌入達髕韌帶下，由上而下松解，出刀并加壓片刻。

1.5 取材

各組動物在治療結束3周后以空氣栓塞法處死進行取材。超凈工作臺上以銳利刀片于股骨外側髁快速切取拇指指甲大小全新鮮軟骨組織，液氮冷凍，－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標檢測

1．6．1 RT-PCR法檢測軟骨整合素β1基因表達 表1顯示，取10～20 mg組織，使用“動物組織RNA提取試劑盒”進行提取。經(jīng)檢測所有標本RNA濃度為20～50 ng/ul，且OD260/OD280介于1.9～2.1之間。對RNA使用反轉錄試劑盒進行反轉錄反應使其轉換成cDNA，反應體系為20 μL，其中RNA模板5 μL，10×RT buffer 2 μL，Oligo dT引物2 μL， dNTP Mixture 2 μL， QuantReverse Transcriptase 1 μL，RNaese-free ddH2O 8 μL;反應程序為37℃60 min。反應體系為20 μL，其中cDNA模板0.4 μL，上下游引物(濃度為10 μM)各0.3 μL，2×SuperReal PreMix 10 μL，RNaese-free ddH2O 9 μL。反應程序為95℃變性15 min后，95℃ 10 s，60℃ 32 s共45個循環(huán)［4］。用相對定量法分析結果，用各個樣本的目的基因的Ct值-各個樣本的內參基因(beta actin)的Ct值，得到ΔCt;用處理組的ΔCt-空白組ΔCt的均值，得到ΔΔCt;各組與空白組比較其待測基因 mRNA的相對表達水平 =2－ΔΔCt。兔Integrin-β1、GAPDH引物，以GAPDH為內參照，各引物序列和產(chǎn)物大小如下。

表1 引物序列和產(chǎn)物值

1．6．2 Western blot法檢測軟骨整合素β1蛋白表達 預冷RIPA蛋白抽提試劑加入蛋白酶抑制劑。在蛋白抽提開始前加入0.1 M PMSF母液，PMSF終濃度1 mM。將兔膝關節(jié)軟骨組織從液氮中取出，稱取組織質量:裂解液體積=1∶9比例加入裂解液，用眼科剪剪碎組織塊，F(xiàn)luka電動組織勻漿器15000 rpm轉速進行勻漿，每次10 s，間隔10 s，進行3次勻漿。勻漿時EP管需要浸入冰水混合物中進行降溫。勻漿完成后在冰上孵育20 min，4℃離心，13000 rpm，20 min。離心完成后取上清，分裝保存，用BCA法蛋白定量法測定蛋白含量后，以RIPA調整蛋白濃度，加入5×還原樣品緩沖液后樣品終濃度為4 mg/ml，煮沸變性5 min。

1．6．3 目的蛋白WB檢測 根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%，待檢測蛋白樣品上樣量20 ug/孔，電泳條件為濃縮膠恒壓90V，約20 min，分離膠恒壓160 V，通過預染蛋白marker來確定電泳停止時間。大分子量蛋白integrinβ-1300 mA恒流，0.45 um孔徑NC膜，轉膜時間2 h，轉膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，將膜完全浸沒在3%BSA-TBST中室溫輕搖30 min。用3%BSA-TBST按比例1∶500稀釋integrin β1一抗，室溫孵育10 min，放4℃過夜。第2天從4℃拿出膜，在室溫孵育30 min，TBST洗膜5次，每次3 min。用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗鼠IgG(H+L)HRP，1∶10000室溫輕搖40 min;TBST洗膜6次，每次3 min。

1．6．4 內參蛋白WB檢測 Stripping Buffer洗膜，37℃洗膜30 min，去離子水洗膜3次，TBST洗膜3次，每次3 min，將膜完全浸沒3%BSA-TBST中室溫輕搖30 min;加GAPDH鼠單抗，用5%奶粉稀釋抗體，1∶40000稀釋，室溫孵育40 min;TBST洗膜5次，每次3min。用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP，1∶10000，室溫輕搖40 min。TBST洗膜5次，每次3min。

ECL加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光10 s ～5 min(曝光時間隨不同光強度而調整)，顯影2 min，定影。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析。先行正態(tài)性檢驗，發(fā)現(xiàn)結果滿足正態(tài)分布，繼而采用方差齊性檢驗，2組間比較采用LSD檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

2 結果

2.1 針刀干預對 KOA兔軟骨中 Integrinβ1 mRNA表達的影響

表2顯示，兔膝關節(jié)軟骨中Integrinβ1 mRNA表達水平，模型組較空白組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與模型組比較，針刀組與電針組有所上升，與之比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);針刀組與空白組比較，含量基本一致，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);電針組與空白組比較含量還是較低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);針刀組比電針組比較含量相對較多，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表2 各組兔軟骨Integrinβ1 mRNA表達水平比較(±s)

表2 各組兔軟骨Integrinβ1 mRNA表達水平比較(±s)

注:與模型組比較:▲▲P＜0.01;與空白組比較:☆☆P＜0.01

組別 樣本數(shù) Ct值空白組 9 1.08±0.18▲▲模型組 10 0.56±0.16☆☆電針組 9 0.76±0.12▲▲☆☆針刀組 10 0.95±0.13▲▲

2.2 針刀松解法對KOA兔軟骨中Integrinβ1蛋白表達的影響

表3圖1顯示，造模后兔軟骨中Integrinβ1蛋白表達顯著下降，模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);針刀及電針干預后，Integrinβ1蛋白表達水平有所回升，針刀組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);電針組與模型組比較，含量有所提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與空白組比較，針刀組含量與之基本相等，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);電針組含量上升，但與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);針刀組與電針組雖都有上升，但電針組明顯少于針刀組，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表3 各組兔軟骨Integrinβ1蛋白表達水平比較(±s)

表3 各組兔軟骨Integrinβ1蛋白表達水平比較(±s)

注:與模型組比較:▲▲P＜0.01，▲P＜0.05;與空白組比較:☆☆P ＜0.01

組 別 樣本數(shù) Integrinβ1蛋白相對表達量空白組 6 2.98±0.53▲▲模型組 6 0.83±0.33☆☆電針組 6 1.50±0.60▲☆☆針刀組 6 2.69±0.44▲▲

圖1 各組兔軟骨Integrinβ1蛋白Western blot條帶圖

3 討論

整合素是黏附分子中的一類，由a、β亞單位經(jīng)非共價鍵連接而成的異二聚體跨膜糖蛋白［5］。在脊椎動物中已發(fā)現(xiàn)18種不同的α亞單位和8種β亞單位，它們按不同組合構成至少24種整合素［6］。軟骨細胞膜上主要表達整合素β1，以整合素α1β1型、整合素α3β1型、整合素α5β1型多見［7］。其中，α10β1則是穩(wěn)定軟骨細胞表型的最主要分子［8-9］。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，幼年期β1整合素的缺乏會導致嚴重的軟骨發(fā)育不全和關節(jié)的多種異常［10］。軟骨細胞感受外在的應力刺激并將力學信號轉化為細胞內化學信號，進而影響細胞各種生理活動，改變細胞外基質成分使軟骨適應外在的負荷變化，這一過程稱之為力學信號傳導。整合素介導的信號傳導途徑按傳遞方向可分為外向信號傳導和內向信號傳導［11］。其中，內向信號傳導能影響胞內多種靶基因表達，從而調節(jié)細胞增殖、凋亡、黏附、遷移等生理過程，是細胞維持正常生理代謝的關鍵所在［12］。整合素是細胞表面應力受體之一，其通過細胞外基質(extracellular matrix，ECM)/整合素/細胞骨架蛋白形成的黏著斑完成力化學傳導來調控軟骨細胞的增殖和分化功能。整合素是軟骨細胞表面感受力學刺激的受體，能將所感應的力學刺激信號通過細胞表面特殊的分子通道傳遞至胞內不同結構部件上，實現(xiàn)力化學轉換，調節(jié)細胞的生理功能［13］。越來越多的研究表明，整合素對于力學信號的傳入轉化有著重要作用，但是整合素自身在力學刺激下的變化及其機制的研究目前尚未明確，還有待進一步實驗研究。

本實驗采取膝關節(jié)伸直位固定制動法，其關節(jié)力學變化使關節(jié)面負重減小，給關節(jié)軟骨所施加的力量相對升高，生物力學方面的應力平衡失調，膝關節(jié)周圍軟組織的積累性損傷，導致膝關節(jié)動態(tài)力學平衡失調，關節(jié)周圍的韌帶、肌肉等軟組織長時間牽拉無法收縮而受損，從而破壞膝關節(jié)內部的力學平衡，使正常負重的力線發(fā)生變化，關節(jié)軟骨面有效負重面積減少，單位面積內的骨小梁壓力增高，引起骨質增生或微小骨折，導致膝關節(jié)發(fā)生一系列的退行性改變［14］。

通過前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，家兔膝關節(jié)損傷的病理改變及修復過程與人極其相似，具有良好的可重復性及相似性。造模后，兔膝關節(jié)軟骨中，整合素β1mRNA表達水平明顯下降，說明模型制動造成膝關節(jié)力學平衡失調，力學信號發(fā)生轉變，傳導到細胞膜調控了整合素的基因表達。治療之后，針刀組與空白組比較，基因表達上升，其含量基本一致;電針組與空白組比較，其基因含量也有所上升，說明針刀松解法和電針治療對整合素β1基因表達均可產(chǎn)生長期的影響。但從實驗統(tǒng)計結果可以看出，針刀松解法的長期調節(jié)作用要優(yōu)于電針治療。在整合素β1蛋白表達方面，針刀組與空白組之間含量基本相同，說明針刀松解法通過對軟組織的松解，調節(jié)膝關節(jié)力學平衡，而調整整合素β1蛋白的表達水平;電針組與空白組比較，蛋白含量也有所上升，說明電針對整合素蛋白表達也有一定的影響，但針刀組長期提高整合素蛋白表達的能力高于電針組。以上實驗結果表明，膝關節(jié)的制動可以使處于靜壓力狀態(tài)下的膝關節(jié)軟骨細胞發(fā)生嚴重的病理變化，這種應力抑制了整合素β1基因和蛋白的表達，使軟骨發(fā)生相應的細胞凋亡，針刀通過對膝關節(jié)周圍韌帶等軟組織的松解，調整了關節(jié)內部壓力，使得關節(jié)內部的力學信號發(fā)生轉變，提高整合素β1基因和蛋白的表達水平。從針刀的影響來看，整合素介導的信號傳導通路被啟動后，在較長一段時期內，其基因和蛋白表達接近于正常組水平，且針刀松解法調整水平明顯優(yōu)于電針組，說明針刀的長期療效是值得肯定的。

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Long-range Influences of Acupotomy Therapy on Integrinβ1 of Cartilage in Rabbits with Knee Osteoarthritis

ZHANG Li-ping，GUO Chang-qing△
(College of Acupuncture and Moxibustion，Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective To explore the long-range mechanism of needle knife lysis on knee osteoarthritis．Methods:Sixmonth-old New Zealand rabbits were randomly divided into normal control group，model group，acupotomy group，and electro-acupuncture(EA)group．KOA model was established by videman，After modeling，acupotomy group and electroacupuncture group were treated for three weeks，once every week in acupotomy group，and three times in electroacupuncture group．After the treatment，continued to normal breeding three weeks，then testted rabbits’behavior with knee level assessment method;Expression of apoptosis genes integrinβ1 mRNA，was conducted by Real-time PCR test，and expression of apoptosis proteins integrinβ1，was conducted by Western blot test．Results The results of Real-time PCR tests :after modeling，Integrin β1 mRNA expression levels in the rabbit knee cartilage extremely reduced;compared with normal control group showed an extreme difference．After acupotomology intervention and continued to normal breeding three weeks，compared with model group，Integrin β1 mRNA expression levels rose．There was no significant difference between the normal control group and the acupotomology group．Compared with normal control group，Integrin β1 mRNA expression level rose in electro-acupuncture，showing an extreme difference．The results of western blot tests:after modeling，integrinβ1 protein levels in the rabbit knee cartilage reduced abnormally，compared with normal control group showed a significant difference．Acupotomology intervention raised the integrin β1 protein expression levels，and electricity for this regulation raised the integrin β1 protein expression levels．Conclusion:Acupotomology not only can adjust the mechanical signals stimulate cartilage cells and raise the gene and protein expression levels of integrinβ1，but also can improve cartilage matrix．In the long-term observation its content closed to normal．This illustrates the long-term efficacy of Acupotomology is positive．

Osteoarthritis of the knee;Acupotomy;Integrinβ1;Long-range Influences

R244．5

B

1006-3250(2015)10-1291-03

2015-03-17

國家自然科學基金資助項目(81173333)

張麗萍(1988-)，女，山東威海人，醫(yī)學碩士，從事針刀的臨床與研究。

郭長青(1959-)，男，教授，博士研究生導師，從事針刀理論與臨床研究，E-mail:guochangqing66@163．com。