參芪四逆湯對腹主動脈縮窄大鼠心肌纖維化的影響

翟建麗，石月萍

(1．遼寧醫學院，遼寧錦州 121000;2．遼寧醫學院附屬第一醫院中醫科，遼寧錦州 121000)

參芪四逆湯對腹主動脈縮窄大鼠心肌纖維化的影響

翟建麗1，石月萍2△

(1．遼寧醫學院，遼寧錦州 121000;2．遼寧醫學院附屬第一醫院中醫科，遼寧錦州 121000)

目的:觀察參芪四逆湯(黨參、黃芪、附子、干姜、甘草)對腹主動脈縮窄大鼠心肌纖維化的影響，并探討其對心肌轉化生長因子β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF)的影響。方法:采用Doering腹主動脈縮窄法復制心肌纖維化模型。8周后，檢測心臟血流動力學改變，Masson染色法觀察心肌組織形態學改變，免疫組化法和western-blot法檢測心肌TGF-β1和CTGF表達。結果:與模型組比較，參芪四逆湯可以明顯改善大鼠心功能，減少膠原纖維含量，降低心肌TGF-β1和CTGF的表達。結論:參芪四逆湯具有防治心肌纖維化作用，其保護機制可能與其抑制心肌TGF-β1和CTGF表達有關。

心肌纖維化;參芪四逆湯;TGF-β1;CTGF

心肌纖維化是一些心血管疾病終末階段共有的病理特征，表現為心臟細胞外基質異常沉積和間質膠原增加。它是心臟病發生致命事件的一個主要生物因素，包括心臟衰竭、心律失常和心臟性猝死［1-2］，因此抑制心肌纖維化是臨床中的一個關鍵問題。研究表明，TGF-β1誘導成纖維細胞中CTGF表達，促進膠原合成和肌成纖維細胞分化［3］，CTGF直接結合TGF-β1并增強其活性，進而結合增加的轉化生長因子受體I和II［4］。研究認為，四逆湯具有抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、減輕血管損傷后內膜增生等作用［5］。補氣類中藥是治療心衰的有效藥物，能夠減輕心室肥厚［6］。本實驗采用腹主動脈縮窄大鼠心肌纖維化模型，觀察參芪四逆湯對TGF-β1和CTGF表達的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

0.7 mm銀夾(上海奧爾科特生物科技有限公司);參芪四逆湯由黨參(130701)、黃芪(130901)、附子(130801)、干姜(121201)、甘草(130501)組成，采用免煎配方顆粒劑(北京康仁堂藥業有限公司);卡托普利片(H31020564，上海旭東海普藥業有限公司);TGF-β1兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司);DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(碧云天生物技術研究所);CTGF兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司);山羊抗兔IgG抗體(美國Santa Cruz公司);改良Masson三色染色試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)。

1.2 動物

SPF級雄性SD大鼠40只(遼寧長生生物技術有限公司，許可證編號SCXK(遼)2010—0001)，8周齡，體質量180～220 g。在籠中飼養，可自由攝食飲水。

1.3 主要儀器

壓力換能器及心功能儀器(ZS一6000型，日本生產)，3K15臺式高速冷凍離心機(Sigma)，4XBC電腦型雙目倒置式金相顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)，超聲細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備及實驗分組

40只8周齡雄性SD大鼠，按隨機數字表法分為假手術組、模型組、卡托普利組、參芪四逆湯組每組各10只。參照Doering腹主動脈縮窄法，用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，固定、剃毛、常規消毒，在左側肋緣下1 cm處分層打開腹腔，在左腎上緣分開后腹膜等軟組織，暴露腹主動脈并在雙腎上方分離腹主動脈，用銀夾造成腹主動脈部分狹窄(銀夾內徑0.7 mm)，分層關閉腹腔，假手術組只打開腹腔，分離腹主動脈，不用銀夾縮窄。術后3 d用慶大霉素肌肉注射抗感染。

2.2 給藥

術后第4天，假手術組和模型組用蒸餾水(1.5 ml/100 g)灌胃，卡托普利組用卡托普利(100 mg/ kg)灌胃，參芪四逆湯組用參芪四逆湯(黨參∶黃芪∶附子∶干姜∶甘草=5∶5∶5∶3∶2)5.4 g/kg灌胃，按人與動物體表面積計算，每天1次，連續8周。

2.3 指標檢測

2.3.1 血流動力學測定 8周后各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，分離出右側頸總動脈，遠心端結扎，近心端剪口，將連接于壓力轉換器上的內徑1 mm的聚乙烯管沾取石蠟油并送入左心室，即可描述左心室內壓曲線，將左室內壓曲線信號輸入BL-420S生物信號采集處理系統，記錄左室收縮壓(LVSP)和左室舒張末壓(LVEDP)，左室內壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

2.3.2 病理組織形態學觀察 心肌組織在4%多聚甲醛中固定，脫水透明浸蠟包埋，制備約4 μm厚組織切片，行Masson染色(膠原纖維呈藍色，肌纖維、胞質、紅細胞呈紅色，胞核呈藍褐色)，最后中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌組織病理形態學變化，隨機取5個視野，圖像分析儀測量心肌膠原容積分數(CVF)。

2.3.3 免疫組化檢測心肌TGF-β1和CTGF表達 心肌組織切片常規脫蠟至水、抗原修復，3% H2O2消除內源性過氧化物酶活性，加一抗4℃過夜，復溫加二抗，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片，結果呈棕黃色即為陽性表達。每只大鼠取5張切片，隨機選取每張切片中的3個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析，分別計算其灰度值IOD，用均數表達強度。

2.3.4 western blot法檢測心肌 TGF-β1和CTGF表達 從－80℃取出部分心肌組織加裂解液，提取蛋白，BCA法進行蛋白定量、制膠、加樣、電泳，SDS-PVDF膜轉印，加一抗4℃搖床過夜，TBST液洗膜，加二抗ECL顯色，活體成像系統機掃描成像。用Image J軟件計算分析，測定其RD值。

2.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，參數以均數±標準差(±s)表示，所有數據進行正態性和方差齊性檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析，2組間均數多重比較用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血流動力學變化

表1顯示，8周末與假手術組比較，模型組左室收縮壓和左室內壓最大上升及下降速率顯著降低，左室舒張末壓顯著升高;與模型組比較，卡托普利和參芪四逆湯組左室收縮壓和左室內壓最大上升及下降速率顯著升高，左室舒張末壓顯著降低，差異有統計學意義，而卡托普利和參芪四逆湯組比較差異無統計學意義。

表1 各組大鼠血流動力學比較(±s)

表1 各組大鼠血流動力學比較(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別 例數 左室收縮壓(mmHg)左室舒張末壓(mmHg)左室內壓最大上升速率(mmHg·ms－1)左室內壓最大下降速率(mmHg·ms－1)假 手 術 組 10 125.69±13.96 4.75±1.81 4.28±0.68 －(4.17±0.67)模 型 組 10 85.30±17.05** 10.92±2.96** 2.23±0.76** －(2.14±0.74)**卡 托 普 利 組 10 105.89±15.24**ΔΔ 7.47±1.88**ΔΔ 3.26±0.93ˉˉΔΔ －(3.16±0.89)**ΔΔ參芪四逆湯組 10 103.80±16.68**Δ 7.53±1.86**ΔΔ 3.29±0.94*ΔΔ －(3.19±0.94)*ΔΔ

3.2 心肌組織病理學觀察比較

圖1表2顯示，膠原纖維呈藍色(箭頭處)，心肌細胞及肌纖維呈紅色，在光鏡下可見，假手術組心肌膠原纖維主要分布在血管周圍，心肌細胞間有少量的膠原纖維;模型組血管周圍膠原纖維增厚，心肌細胞間有大量縱橫交錯的膠原纖維，排列紊亂;卡托普利組和參芪四逆湯組膠原纖維的量明顯少于模型組。經計算分析，模型組的CVF高于假手術組，卡托普利和參芪四逆湯組的CVF低于模型組，差異有統計學意義，而卡托普利和參芪四逆湯組比較差異無統計學意義。

3.3 免疫組化法測心肌TGF-β1和CTGF的表達情況

圖1 大鼠心肌組織Masson染色(×200)注:A．假手術組;B．模型組;C．卡托普利組;D．參芪四逆湯組

圖2 、3及表2顯示，各組心肌細胞胞質及間質中有染色為棕黃色顆粒(箭頭處)的TGF-β1表達，胞核有染色為棕黃色顆粒(箭頭處)的CTGF表達。用Image Pro Plus 6.0計算分析，分別測定其灰度值IOD的平均值，與假手術組比較，模型組TGF-β1和CTGF表達水平顯著升高;與模型組比較，卡托普利和參芪四逆湯組的TGF-β1和CTGF表達水平顯著降低，差異有統計學意義，而卡托普利和參芪四逆湯組比較差異無統計學意義。

表2 各組大鼠心肌CVF及TGF-β1和CTGF的IOD值比較(±s)

表2 各組大鼠心肌CVF及TGF-β1和CTGF的IOD值比較(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 例數 CVF(%) TGF-β1(IOD) CTGF(IOD) 10 4.2±0.7 13.3±5.4 16.7± 8.8模 型 組 10 14.3±0.9** 48.1±13.3** 46.4±16.8**卡托普利組 10 8.1±0.8**ΔΔ 22.5± 9.8*ΔΔ 31.6± 7.7**ΔΔ參芪四逆湯組 10 7.4±0.8**ΔΔ 24.5± 7.8*ΔΔ 32.5± 9.7**ΔΔ假手術組

圖2 大鼠心肌組織TGF-β1的免疫組化染色(×400)注:A．假手術組;B．模型組;C．卡托普利組;D．參芪四逆湯組

3.4 western blot法測心肌TGF-β1和 CTGF的表達情況

圖3 大鼠心肌組織CTGF的免疫組化染色(×400)注:A．假手術組;B．模型組;C．卡托普利組;D．參芪四逆湯組

圖4 、表3顯示，假手術組心肌TGF-β1和CTGF的蛋白表達量很低，模型組最高，經卡托普利和參芪四逆湯處理后，其表達下調。用Image J軟件計算分析，測定其RD值(目的條帶的灰度與內參條帶灰度的比值)，與假手術組比較，模型組 TGF-β1和CTGF蛋白表達量顯著升高;與模型組比較，卡托普利和參芪四逆湯組TGF-β1和CTGF的蛋白表達量顯著降低，差異有統計學意義，而卡托普利和參芪四逆湯組比較差異無統計學意義。

圖4 western blot檢測大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF蛋白表達注:A．假手術組;B．模型組;C．卡托普利組;D．參芪四逆湯組

表3 大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF的RD值比較(±s)

表3 大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF的RD值比較(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別 例數 TGF-β1(RD) CTGF(RD) 10 0.19±0.06 0.21±0.06模 型 組 10 0.48±0.12** 0.47±0.14**卡 托 普 利 組 10 0.32±0.08**ΔΔ 0.32±0.06**ΔΔ參芪四逆湯組 10 0.34±0.08**ΔΔ 0.30±0.08*ΔΔ假 手 術 組

4 討論

心肌纖維化是指由各種原因導致的心肌間質心肌成纖維細胞增殖、細胞外基質沉積、細胞死亡以及血管再生［7］。研究表明，心肌纖維化的形成不僅僅是膠原的沉積，且通過多種細胞因子相互作用，其中包括血管緊張素Ⅱ、轉化生長因子、結締組織生長因子、纖維母細胞生長因子、血小板活化生長因子、炎性因子、5-羥色胺、胰島素樣生長因子1、細胞外基質分子［7-8］。

研究表明，TGF-β1是一類能夠調節細胞生長分化的多肽，參與細胞的增殖、分化、遷移、凋亡和基質的形成，能促進成纖維細胞的轉化，抑制細胞外基質降解，增加細胞外基質mRNA表達和蛋白合成。研究表明，TGF-β1在心肌纖維化的過程中起重要作用，且可能是諸多因素導致心肌纖維化最后共同的中介物之一［9-10］。CTGF是TGF-β1誘導產生的，其通過自身促使纖維化和心肌肥厚的作用非常微弱，但它通過TGF-β1介導則表現出強大的致纖維化和心肌細胞肥厚效應［11-12］。有研究表明，中和 CTGF能在很大程度上減輕同種異體心臟移植所引起的慢性移植反應所致心肌纖維化，且再一次證明TGF-β1為CTGF的上游介導因子［13］。此外，TGF-β1的致纖維化效應可被CTGF反義寡核苷酸阻斷［14］。

四逆湯出自《傷寒論》，有溫中祛寒、回陽救逆之效。現代研究證明，四逆湯可以抑制 TGF-β1mRNA和蛋白的表達，從而防治球囊損傷內膜后血管的狹窄［15-16］。此外，四逆湯能夠通過TGF-Smads通路減輕異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化，并有效改善心臟舒張功能［17-18］。另有研究證明，益氣中藥(黨參、黃芪)具有正性肌力作用，并能逆轉心衰大鼠心室重構過程［19］。黃芪注射液被證明能夠改善腎性高血壓大鼠血流動力學變化，從而逆轉左心室肥厚及纖維化的進程［20］。

綜上所述，TGF-β1和CTGF是心肌纖維化進程中2個重要的細胞因子。為此，本文探討參芪四逆湯對腹主動脈縮窄大鼠心肌纖維化左室重塑及心肌TGF-β1和CTGF表達的影響。結果顯示，腹主動脈縮窄術后8周末，模型組大鼠的血流動力學指標提示壓力負荷大鼠心肌結構重塑、纖維化已經形成。參芪四逆湯干預治療8周，血流動力學指標以及心肌膠原容積分數均明顯改善，提示參芪四逆湯可以抑制壓力負荷大鼠心肌纖維化的進展。同時，參芪四逆湯降低大鼠心肌組織中TGF-β1和CTGF的表達。此外，與同期的卡托普利治療組比較，參芪四逆湯治療組大鼠一般情況較好、皮毛稠密、光澤度較好、無咳嗽等癥狀。因此，推測參芪四逆湯可以抑制腹主動脈縮窄大鼠心肌纖維化的發展，可能與其抑制心肌組織中TGF-β1和CTGF的表達作用有關，但其確切機制有待于進一步深入研究。

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Effects of Shenqi Sini decoction on myocardial fibrosis in the rats with narrow constriction of the abdominal aorta

ZHAI Jian-li1，SHI Yue-ping2△

(1．Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China;2．Department of traditional Chinese medicine，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China．)

Objective:To study the effect of Shenqi Sini decoction(Codonopsis pilosula，Astragalus mongholicus，radix aconiti carmichaeli，rhizoma zingiberis，liquorice)on myocardial fibrosis rats with abdominal aorta banding，and explore its effect on the expression of transforming growth factor β1(TGF-β1)and connective tissue growth factor(CTGF)in myocardium．Methods:The models were established by partially banding of abdominal aorta according to Doering’s method．Eight weeks later，hemodynamics changes of heart were tested，the changes of myocardial tissue morphology were observed by Masson staining，the expression of TGF-β1 and CTGF were tested by immunohistochemistry method and Western blotting．Results:Compared with the model group，Shenqi Sini Decoction can obviously improve heart function of rats，reduce the content of collagen fibers and depress the expression of myocardial TGF-β1and CTGF．Conclusion:Shenqi Sini decoction can inhibit the expression of myocardial TGF-β1and CTGF，which may explain the mechanism of its protective effect on myocardium with fibrosis．

Myocardial fibrosis;Shenqi Sini decoction;TGF-β1;CTGF

R285．5

B

1006-3250(2015)04-0406-04

2014-12-05

翟建麗(1987-)，女，河南輝縣人，在讀碩士，從事中藥對心血管疾病的防治與研究。

△通訊作者:石月萍，女，教授，醫學博士，碩士研究生導師，Tel:0416-4197027，E-mail:lnjzsyp@163．com。