他拉達非對肺動脈高壓模型大鼠降鈣素基因相關肽、p27及 p-ERK1／2表達的影響

姜波

（濟寧醫學院附屬醫院胸外科，山東 濟寧 272000）

他拉達非對肺動脈高壓模型大鼠降鈣素基因相關肽、p27及 p-ERK1／2表達的影響

姜波

（濟寧醫學院附屬醫院胸外科，山東 濟寧 272000）

目的 分析他拉達非對肺動脈高壓模型大鼠降鈣素基因相關肽（CGRP）、p27及p-ERK1／2表達的影響。方法 將36只雄性SD大鼠隨機分為肺動脈高壓（PAH）組（A組），他拉達非組（B組）及對照組（C組），各12例。觀察各組大鼠血流動力學及肺血管形態學變化，以Western Blot法分析肺動脈CGRP，p27及p-ERK1／2的表達。結果 與A組比，B組聚天冬氨酸（PASP）、平均肺動脈壓（mPAP）顯著降低(P＜0.05)，游離右室壁（RV）／（左室+室間隔）（LV+S）在 A，B組間無顯著性差異（P＞0.05），但均顯著高于 C組(P＜0.05)；A組右心室肥大程度及肺血管結構變化顯著高于B組(P＜0.05)，且均顯著高于C組(P＜0.05)；A組大鼠CGRP，p27表達顯著降低(P＜0.05)，p-ERK1／2表達顯著上調(P＜0.05)，經他拉達非干預后改善，但與C組相比，差異仍有統計學意義(P＜0.05)。結論 他拉達非能顯著改善PAH模型大鼠的血管重構，CGRP及ERK1／2／p27在其中可能扮有重要作用。

他拉達非；肺動脈高壓；降鈣素基因相關肽；血管重構

肺動脈高壓（PAH）是以平滑肌細胞增生、肺血管收縮及重構為特征的疾病，能引起患者右心室肥厚、肺血管阻力增加最終導致患者右心衰竭和死亡。近年的研究顯示，血管重構是PAH發生和發展的重要病理生理機制，肺動脈平滑肌細胞的過度增殖與遷移是引起血管重構的關鍵因素[1]。降鈣素基因相關肽（CGRP）是感覺神經的重要遞質，是目前已知最強的舒血管物質，在調節血管阻力和維持血壓穩定等方面有重要作用[2]，而p27及ERK1／2參與的信號通路在調節血管平滑肌細胞增殖及血管重構方面亦有重要作用。他達拉非為5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑，廣泛應用于治療肺動脈高壓，但其作用機制尚未完全明了。本研究中基于CGRP具有降壓及抑制血管重構的作用，探討了 CGRP及ERK1／2／p27在他達拉非降低肺動脈高壓、預防緩解肺血管重構中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Model680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；BL-410型多功能生理記錄儀（成都泰盟科技有限公司）；Mini PROTEAN電泳系統（美國Bio-Rad公司）。

試藥：鹽酸他達拉非片（美國 Elilillyand公司，國藥準字H20120472，規格為每片 20 mg)，藥片粉碎后溶于 10 mL生理鹽水備用；野百合堿（MCT，Sigma公司，批號為063K1183)，溶于1 mol／L稀 HCl溶液，制成1% 濃度溶液，調pH至7.2，加生理鹽水配制成10 g／L MCT溶液。兔抗鼠CGRP多克隆抗體（美國Sigma公司）；小鼠抗大鼠p27單克隆抗體、小鼠抗大鼠ERK1／2單克隆抗體、小鼠抗大鼠p-ERK1／2單克隆抗體、小鼠抗大鼠GADPH單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

動物：36只健康雄性SD大鼠，SPF級，體重180～200 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK（粵）2011-0015。動物飼養及所有操作流程均遵守《實驗動物管理條例》，可自由進食及飲水。

1.2 方法

動物模型建立：適應性飼養5 d后，將36只雄性SD大鼠隨機分為3組，每組12只，A組為MCT誘導肺動脈高壓（PAH）組，B組為他達拉非組，C組為對照組。A組、B組大鼠給予皮下注射已配制好的MCT溶液60 mg／kg，C組給予腹部注射相應劑量生理鹽水，相同條件下喂養，自由飲食、飲水。4周后，動物模型經胸體彩超鑒定后，B組大鼠給予0.5 mg／(kg·d)他達拉非溶液灌胃處理，A組、C組給予相同劑量生理鹽水灌胃處理，相同條件飼養4周后，取材進行相關檢測。

血流動力學及右心室肥厚病變分析：試驗中大鼠水合氯醛腹腔麻醉后將右心導管預充肝素鹽水后與壓力換能器相連，用20號套管針經右心室穿刺至肺動脈主干記錄肺動脈收縮壓（PASP）及平均肺動脈壓（mPAP）；處死大鼠，結扎主動脈，取心、肺，經生理鹽水漂洗后結扎肺動脈，分離心臟，秤取游離右室壁和左室+室間隔質量（RV，LV+S），計算右心肥厚指數RV／(LV+S)。

肺血管形態學觀察：石蠟包埋固定并切片，將切片經HE染色后置于顯微鏡下觀察，隨機選取直徑50～150 μm肺小動脈標本，用圖像分析技術計算肺血管內外管徑均值，管壁厚度(WT)，膜厚度占管腔比例(WT，%)=2×WT／ED，管壁橫截面面積占管腔面積的比例(WA，%)=（TA-IA）／TA。

Western Blot法分析 CGRP，p27及 ERK1／2表達水平：在液氮中將肺動脈研磨成粉末加200 μL裂解液（50 mmol／L Tris-HCl pH=8.0，150 mmol／L PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑）。4℃12 000 r／min離心 15 min，取上清，采用 Bradford法檢測蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50 μg上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進行圖像分析。

1.3 統計學處理

2 結果

結果見表1和表2，圖1和圖2。

表1 3組大鼠血流動力學及右心肥厚指數比較（±s，n=12）

表1 3組大鼠血流動力學及右心肥厚指數比較（±s，n=12）

組別A組B組C組PASP（mmHg）39.06±6.61β＃31.04±4.02β27.96±3.07 mPAP（mmHg）24.16±2.39β＃20.11±2.06β12.92±1.71 RV／（LV+S）（%）44.28±5.34β34.92±6.11β28.14±5.96

注：與C組比較，βP＜0.05；與B組比較，＃P＜0.05。下表同。

表2 3組大鼠肺動脈結構變化比較（±s，n=12）

表2 3組大鼠肺動脈結構變化比較（±s，n=12）

組別A組B組C組WT(%) 36.51±6.04β＃26.91±5.17β18.06±3.26 WA(%) 56.71±5.28β＃41.64±4.63β28.53±4.17

圖1 3組大鼠肺血管形態圖（HE，×200）

3 討論

PAH是指累及肺小動脈且以平滑肌與肺血管內皮細胞異常增生為特點的一種肺血管疾病，隨著疾病的發展，可導致患者右心室壓力增大，出現擴張、肥大，心室對血液動力壓力反應減弱[3]，最終導致患者右心衰竭死亡。隨著研究的深入，發現剪切力、缺氧、炎癥及藥物刺激能使肺血管內皮細胞結構、功能及代謝發生紊亂，啟動 PAH的發生[4]。血管內皮損傷破壞了其屏障作用，干擾了平滑肌細胞與內皮細胞間的內皮-肌連接作用，促進肺血管平滑細胞過度增殖，引發肺血管重構[5]。而在肺血管重構的過程中細胞周期調控相關因子在其中發揮重要的作用，p27作為細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的負調節因子，能通過抑制 cyclin／CDK復合物的磷酸化，降低其活性，阻止細胞過度增殖。動物試驗研究[6]顯示，激活 ERK1／2信號通路可促進 p27的降解，導致細胞進入細胞增殖周期。Qin等[7]的研究結果顯示，在肺動脈平滑肌及細胞中CGRP能顯著抑制血管緊張素Ⅱ的表達，而ERK1／2在此過程中被激活。

圖2 Western Blot法分析各組CGRP，p27及ERK1／2表達

目前，PAH治療的選擇一般包括藥物治療、介入及外科治療，其中藥物治療包括鈣離子拮抗劑、內皮素受體拮抗劑等肺動脈血管擴張劑，通過阻斷肺動脈高壓發病的不同環節起作用，取得了較好的療效。但介入及外科治療，包括肺移植、心肺聯合移植及經皮球囊房間隔造口術，手術風險大，術后并發癥多[8]。他達拉非為新型長效、具有選擇性的磷酸二酯酶抑制劑，具有較好的耐受性，能長時間擴張血管，提高運動耐量，降低惡化發生率，可顯著改善患者的生活質量[9]。

本研究中，采用野百合堿建模，且后期對大鼠血流動力學變化及右心肥厚指標分析，結果顯示PAH模型組RVSP及mPAP顯著增高，他拉達非干預后下降但仍高于對照組，提示采用野百合堿造模成功。RV／（LV+S）在模型組和干預組無顯著性差異，但均顯著高于對照組，提示造模過程大鼠已經出現右心結構異常。光鏡下模型組肺動脈血管內皮細胞重癥脫落，管腔不規則增厚，狹窄甚至閉塞，管腔內殘留大量紅細胞，肺泡腔內見大量炎性細胞浸潤。WA及WT%結果提示，經他拉達非干預后，肺小血管重構得到改善。Western Blot法分析結果證實，A組CGRP，p27顯著降低，而 p-ERK1／2表達顯著升高，與 Zhang等[10]的研究結果一致，內源性CGRP的消耗能加重PAH血管重構，其作用機制可能與抑制ERK1／2磷酸化，進而上調p27的表達有關。

綜上所述，他拉達非能顯著改善PAH模型大鼠的血管重構，CGRP、p27及ERK1／2在其中可能具有重要作用。

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Expression of CGRP,p27 and p-ERK1／2 in Tadalafil-Intervened Pulmonary Arterial Remodeling Rats

Jiang Bo
(Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital to Jining Medical College,Jining,Shandong,China 272000)

Objective To analyze the expression of CGRP,p27 and p-ERK1／2 in Tadalafil-intervention pulmonary arterial remodeling rats.M ethods 36 male SD rats were randomly divided into PAH model group(A),Tadalafil-intervention group(B)and control group (C),the blood flow dynamics and rats pulmonary vascular morphology change were observed,the expressions of pulmonary CGRP,p27 and p-ERK1／2 were analyzed.Results Compared with model group,the intervention group PASP,mPAP significantly reduced(P＜0.05),RV／(LV+S)had no significant difference(P＞0.05),but both were higher than control group(P＜0.05);the model rats right ventricular hypertrophy and pulmonary vascular structural changes was significantly higher than the intervention group(P＜0.05); CGRP,p27 expression in model group was significantly reduced,p-ERK1／2 expression significantly increased(P＜0.05),after Tadalafl intervention significantly improved,but also has a significant difference with control group(P＜0.05).Conclusion Tadalafil significantly improve PAH model rat vascular remodeling,CGRP,ERK1／2／p27 may play an important role.

tadalafil;pulmonary hypertension;CGRP;ERK1／2

R965；R972+.4

A

1006-4931(2015)23-0027-03

姜波，大學本科，主治醫師，主要從事胸外科工作，（電子信箱）bojiang1214＠163.com。

2015－07－23)