鐵皮石斛組培苗生根條件優(yōu)化研究

彭文書+馬莉+趙苗苗+張文杰+嚴(yán)亮

摘 要 以鐵皮石斛無菌幼苗為材料，在不同生根培養(yǎng)基中添加不同配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、香蕉汁、馬鈴薯汁以及活性炭，研究其對(duì)鐵皮石斛組培苗生根效果的影響。研究結(jié)果表明，生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+10.0%香蕉汁+10.0%馬鈴薯汁+NAA 0.4 mg/L+2.0%蔗糖+0.04%活性炭，生根條件為光照強(qiáng)度2 000 lx、瓊脂用量7.0 g/L、培養(yǎng)基pH為5.8是最適宜條件。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛 ；組培苗 ；生根條件 ；優(yōu)化

分類號(hào) S567.23+9

鐵皮石斛（Dendrobium officinale） 為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium sw.）植物，是一種十分珍貴的中藥材植物，主要分布于我國(guó)云南、廣西、廣東、貴州等南方省區(qū)[1]。鐵皮石斛是《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的5種石斛屬植物之一[2]。鐵皮石斛具有較高的藥用價(jià)值，《中國(guó)藥學(xué)大詞典》稱其具有“滋養(yǎng)陰津”功效，清代《藥性論》說石斛能補(bǔ)腎積精、養(yǎng)胃陰、益氣力和增強(qiáng)體質(zhì)。石斛作為益胃生津藥在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草再新》中均有記載[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)鐵皮石斛的研究表明，多糖是一種有價(jià)值的中藥類免疫增強(qiáng)劑。藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛的多糖、氨基酸、生物堿等成分，具有提高免疫功能、抗氧化、抑制腫瘤和降低血糖等作用[4-9]。但由于鐵皮石斛生長(zhǎng)條件十分苛刻，自然產(chǎn)量極少，加上生態(tài)破壞和藥農(nóng)的過度采挖，致使鐵皮石斛野生資源的有些品種已面臨滅絕的境地。野生石斛在自然條件下的繁殖率很低，林下移栽種植鐵皮石斛成活的關(guān)鍵因素卻是組培苗的生根壯苗，因此在組織培養(yǎng)過程中提高組培苗生根率尤為重要。

本文選擇生長(zhǎng)一致的的鐵皮石斛組培瓶幼苗，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度、不同添加物及濃度對(duì)鐵皮石斛生根和生長(zhǎng)的影響，以確定適合鐵皮石斛壯苗生根最適宜的培養(yǎng)基，提高林下移栽鐵皮石斛組培苗的成活率。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛無菌試管幼苗由普洱茶研究院民族藥膳實(shí)驗(yàn)室購進(jìn)，選取3～4 cm無根或少量細(xì)根的鐵皮石斛無菌試管幼苗為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度26℃，濕度50%～60%，光照強(qiáng)度2 000 lx，每天光照12 h，培養(yǎng)基pH為5.8。

1.2.2 試驗(yàn)方法

在無菌條件下將材料取出，分別接種到所配制的生根壯苗培養(yǎng)基中。生根壯苗培養(yǎng)基設(shè)5個(gè)變量，分別是：6-BA、NAA、香蕉汁、馬鈴薯汁和活性炭。香蕉汁的制作方法是先按比例稱取香蕉之后打成汁，而馬鈴薯汁是先按比例稱取馬鈴薯后用水煮沸過濾出汁。每個(gè)處理培養(yǎng)基在1/2 MS基礎(chǔ)中均加入20 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂，每處理接種10瓶，每瓶接種5株。培養(yǎng)1周后觀察統(tǒng)計(jì)幼苗的成活情況，并進(jìn)行測(cè)量計(jì)算生根率、生根數(shù)、根長(zhǎng)和苗高，取其平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)比較，分析不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)情況的影響。

基本培養(yǎng)基均為1/2MS。

1.2.2.1 不同濃度6-BA對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

變量6-BA的量為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L。

培養(yǎng)基其他添加物為香蕉汁6.0%+馬鈴薯汁6.0%+活性炭0.2%+瓊脂7.0 g/L+蔗糖2.0%。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.2 mg/L。

編號(hào)分別為S1，S2，S3，S4。

1.2.2.2 不同濃度NAA對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

變量NAA的量為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L。

培養(yǎng)基其他添加物為：香蕉汁6.0%+馬鈴薯汁6.0%+活性炭0.2%+瓊脂7.0 g/L+蔗糖2.0%。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA0.3 mg/L。

編號(hào)分別為S5，S6，S7，S8。

1.2.2.3 不同濃度香蕉汁對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

變量香蕉汁的比例為6.0%，8.0%，10.0%，12.0%。

培養(yǎng)基其他添加物馬鈴薯汁6.0%+蔗糖2.0%+活性炭0.2%+瓊脂7.0g/L。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.3 mg/L。

編號(hào)分別為S9，S10，S11，S12。

1.2.2.4 不同濃度馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

變量馬鈴薯汁的比例為6.0%，8.0%，10.0%，12.0%。

培養(yǎng)基其他添加物香蕉汁10.0%+蔗糖2.0%+活性炭0.2%+瓊脂7.0g/L。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.3 mg/L。

編號(hào)分別為S13，S14，S15，S16。

1.2.2.5 不同濃度活性炭對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

變量活性炭的量為0.0%，0.1%，0.2%，0.4%。

培養(yǎng)基其他添加物馬鈴薯汁10.0%+香蕉汁10.0%+蔗糖2.0%+瓊脂7.0 g/L。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA 0.6 mg/L+6-BA 0.3 mg/L。

編號(hào)分別為S17，S18，S19，S20。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.005為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)生長(zhǎng)的影響

為研究不同添加物對(duì)石解試管苗壯苗和生根的影響，以l/2 MS為基本培養(yǎng)基。

2.1.1 不同濃度6-BA對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1，圖1）表明：接種后S3出根時(shí)間最短33.5 d，轉(zhuǎn)接的組培苗開始長(zhǎng)出新根；S1小苗生長(zhǎng)整齊但苗分化較少，有原球莖增殖，葉片綠，根系欠發(fā)達(dá)；S2和S3二者效果都差別不大，區(qū)別在于S3分苗最多，為5.11株，植株的莖粗和葉片數(shù)達(dá)2.41 cm和9.08片；S4葉片黃，根系少且短，節(jié)間有膨大并有不定芽長(zhǎng)出。由此可見，細(xì)胞分裂素6-BA的濃度過高或者過低，均不利于石斛組培苗的生長(zhǎng)，當(dāng)6-BA濃度為0.3 mg/L時(shí)，對(duì)根的誘導(dǎo)效果最佳。在6-BA濃度為0.4 mg/L時(shí)，不定芽的形成有促進(jìn)作用。6-BA的濃度越小越傾向于原球莖的增殖，而隨著其濃度的升高，不定芽的分化率也隨之升高。這與6-BA具有誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大和高濃度抑制根的分化的作用相一致。

2.1.2 不同濃度的NAA對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA對(duì)鐵皮石斛生根的誘導(dǎo)率也有所不同（表2，圖2）。當(dāng)NAA為0.2 g/L時(shí)，生根最少，平均根數(shù)為6.82條，苗長(zhǎng)勢(shì)慢；NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，生根數(shù)8.06條，苗生長(zhǎng)較快；NAA濃度增至0.6 mg/L時(shí)，生根數(shù)為8.79條，且苗長(zhǎng)勢(shì)較快，葉肥綠；當(dāng)其濃度增加到0.8 mg/L時(shí)，其生根數(shù)降為5.45條。隨著NAA濃度的升高對(duì)根的誘導(dǎo)反而下降，且生長(zhǎng)一段時(shí)間后苗會(huì)枯黃并且有死亡出現(xiàn)，打開瓶蓋可聞見酸臭味，測(cè)得培養(yǎng)基的pH<4.3，所以NAA濃度太高，不適宜鐵皮石斛試管苗的生長(zhǎng)。故本處理確定NAA 0.6 mg/L為最適宜濃度，生根誘導(dǎo)率最高，對(duì)石斛芽苗和莖的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。

2.2 不同濃度的香蕉汁對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

隨著香蕉汁比例發(fā)生變化，石斛叢生芽的生長(zhǎng)時(shí)間縮短，并且根的數(shù)目也有所增多（表3，圖3）。香蕉汁比例為6.0%和8.0%的培養(yǎng)基都可以滿足石斛苗的正常生長(zhǎng)，葉色正常，節(jié)間莖粗壯，根系較好，原球莖增殖較少；香蕉汁比例為10.0%的培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度與6.0%和8.0%相比有顯著差異，葉色濃綠，根系發(fā)達(dá)，莖粗壯；香蕉汁比例為12.0%的培養(yǎng)基產(chǎn)生較多的原球莖并分化出小苗。由于香蕉汁中含有豐富的糖類和有機(jī)質(zhì)，可為植物組織細(xì)胞分裂分化提供能源，并且，香蕉汁中含有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、乙烯和赤霉素等。所以，在石斛培養(yǎng)基中添加比例為10.0%的香蕉汁，對(duì)石斛的生長(zhǎng)促近作用最大。

2.3 不同濃度的馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

馬鈴薯汁對(duì)苗根的生長(zhǎng)也起到了一定的作用。在馬鈴薯汁比例為6.0%的培養(yǎng)基中，石斛苗的株高、莖粗、葉片數(shù)明顯不如馬鈴薯汁比例為8.0%和10.0%時(shí)的培養(yǎng)基，且根系欠發(fā)達(dá)（表4，圖4）。而馬鈴薯汁比例為12.0%的培養(yǎng)基則對(duì)石斛苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，生長(zhǎng)情況反而不如比例為8.0%和10.0%好，苗弱，根系發(fā)達(dá)但纖細(xì)，有大量的原球莖產(chǎn)生。因此，馬鈴薯汁的比例為8.0%最好。在進(jìn)行石斛原球莖增殖時(shí)則可以把馬鈴薯汁比例提高到12.0%對(duì)于誘導(dǎo)原球莖有利。在馬鈴薯汁比例為10.0%時(shí)，苗高為6.52 cm，莖粗為2.43 cm，葉色濃綠或淡綠，葉片數(shù)增加到6.54片，每株苗根數(shù)增多為8.04條。馬鈴薯汁的作用方式有可能與香蕉汁相同，都能促進(jìn)石斛生長(zhǎng)。

2.4 活性炭對(duì)鐵皮石斛的生根生長(zhǎng)的影響

活性炭的添加對(duì)石斛苗生根和長(zhǎng)勢(shì)均有促進(jìn)作用（表5，圖5）。活性炭濃度從0.0%增至0.04%時(shí)，生根率從25%增至100%，平均根數(shù)從1.49條增至8.96條，且S19苗長(zhǎng)勢(shì)顯著快于S20。因此，本處理確定0.4%活性炭更有利于石斛苗的生根和生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

前人研究的影響鐵皮石解組織培養(yǎng)因素的結(jié)果表明，以生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)添加培養(yǎng)基而言，6-BA對(duì)石斛試管苗生根具有促進(jìn)作用，這與陳兆貴等[10]的結(jié)論相似。汪杰、蔣林和蔣向輝等[11-13]研究認(rèn)為，附加物中含有各種天然營(yíng)養(yǎng)成分及各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；李小軍和Huang等[14-15]認(rèn)為，經(jīng)馬鈴薯汁、香蕉汁培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)健壯，對(duì)生根壯苗較為有利。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，但本試驗(yàn)在使用附加物的種類和濃度與前人有所不同。

在前人研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)在使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度和附加物的種類與前人有所不同，進(jìn)一步尋找生根壯苗的最優(yōu)培養(yǎng)基配比的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，生長(zhǎng)至3 cm以上的鐵皮石斛組培苗在以生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+10%香蕉汁+10%馬鈴薯汁+NAA 0.4 mg/L+2%蔗糖+0.04%活性炭，光照強(qiáng)度為2 000 lx、瓊脂用量7.0 g/L、pH 5.8的條件下培養(yǎng)60 d后苗高最高可達(dá)7～8 cm、莖粗可達(dá)1～2 cm、根長(zhǎng)可達(dá)5～7 cm，足夠達(dá)到出瓶的要求。另外，在試驗(yàn)中還新發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選用初始材料時(shí)，帶些許短細(xì)根的初始材料，無論是長(zhǎng)勢(shì)還是生根情況，都要優(yōu)于無根的試管苗。本實(shí)驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有的石斛組培育苗技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，優(yōu)選組培適宜林下仿生種植的石斛品種，為石斛仿生種植規(guī)模化推廣示范種植提供技術(shù)支撐。

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