兒童多重耐藥腸球菌感染流行病學及耐藥基因篩選

張書婉，黃君華

(1.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003；2.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021)

兒童多重耐藥腸球菌感染流行病學及耐藥基因篩選

張書婉1，黃君華2

(1.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003；2.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021)

目的 了解兒童感染腸球菌的臨床分布、耐藥表型和耐藥基因的攜帶情況，為臨床合理用藥、控制院內感染及流行病學調查提供依據。方法收集西安市兒童醫院2014年2月至2015年1月分離的腸球菌180株，用K-B法檢測12種抗菌藥物的耐藥情況，運用多重PCR檢測aac(6')-Ie-aph9(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id、erm(B)、mef(A)、tet(M)、tet(L)等耐藥基因。結果在180株臨床分離株中屎腸球菌118株，糞腸球菌46株，其他腸球菌16株；其中分離自尿液的最多，占34.4%。藥敏結果顯示屎腸球菌對紅霉素和四環素的耐藥率分別為84.7%和67.8%，高濃度慶大霉素耐藥(HLGR)菌株占83.0%；糞腸球菌對紅霉素和四環素的耐藥率為82.6%和82.6%，HLGR菌株占73.9%；未發現利奈唑胺和萬古霉素耐藥菌株。140株HLGR腸球菌中aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia檢出率為92.8%，aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id均為陰性。150株紅霉素耐藥菌株中erm(B)基因的檢出率為66.6%，未檢測到mef(A)基因。126株四環素耐藥菌株中，tet(M)和tet(L)的檢出率分別為98.4%和80.9%。結論兒童腸球菌感染主要由屎腸球菌和糞腸球菌引起，且以尿路感染最為常見；多重耐藥情況嚴重，耐藥性由多基因支配，HLGR為醫院感染的重要耐藥菌，主要通過aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因介導；紅霉素的耐藥性主要通過erm(B)基因介導；四環素的耐藥基因以tet(M)和tet(L)多見。

兒童；腸球菌；流行病學；多重耐藥；耐藥基因

近年來隨著廣譜抗菌藥物的不合理使用，介入性診療手段和免疫抑制劑的大量應用，腸球菌所導致的感染不斷增加，已成為兒童醫院感染的主要病原菌[1]，多重耐藥腸球菌的耐藥問題也越來越引起人們的關注[2]。因此，針對腸球菌的流行病學分析和耐藥監測顯得至關重要。本研究收集西安市兒童醫院住院患兒180份腸球菌菌株，對兒童腸球菌感染流行情況、藥敏結果和耐藥基因進行分析，旨在為兒童腸球菌的預防及臨床合理使用抗生素提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 西安市兒童醫院2014年2月至2015年1月住院患兒送檢標本，經VITEK compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定為腸球菌，共180株。

1.2 試劑 Mueller-Hinton瓊脂、Mueller-Hinton肉湯購自上海中科昆蟲生物技術有限公司。腸球菌瓊脂、腸球菌肉湯購自青島海博生物技術有限公司。慶大霉素、呋喃妥因、奎奴普丁/達福普汀、四環素、紅霉素、萬古霉素、氨芐西林/舒巴坦、左氧氟沙星、氯霉素、利奈唑胺、青霉素、氨芐西林購自英國Oxoid公司。

1.3 藥敏實驗 按照美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的K-B藥敏紙片擴散法進行藥敏實驗，判讀標準以臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)2010年制定的規程進行。質控菌株糞腸球菌ATCC 29212和金黃色葡萄球菌ATCC 25923與檢測菌株平行進行藥敏測定。

1.4 腸球菌DNA的提取及耐藥基因的檢測 應用Bacterial DNA Extraction Mini Kit法(TIANGEN，China)，具體操作步驟見試劑盒說明書。aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id基因引物參照文獻[3]，erm(B)、mef(A)、tet(L)、tet(M)基因引物分別參照文獻[4-6]，由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系和條件：10×buffer 2.5μl，10 mmol/L dNTP 0.25μl，25 mmol/L MgCl22.5μl，3.3μmol/L引物各0.5μl，Taq酶(5 U/μl)0.125μl，DNA模板1μl，ddH2O 17.625μl。PCR熱循環參數：aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia、aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic、aph(2'')-Id基因：94℃預變性10 min，然后94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循環35周期，最后72℃延長至5 min。erm(B)、tet(L)、tet(M)基因：95℃預變性5 min，然后93℃1 min，52℃1min，72℃1 min，循環30周期，最后72℃延長至5 min。mef(A)基因：95℃預變性5 min，然后95℃40 s，52℃40 s，72℃1 min，循環30個周期，最后72℃延長至5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。隨機挑取部分PCR擴增產物送上海生工生物技術有限公司進行序列測定，將測序結果與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)核酸數據庫進行比對。

2 結果

2.1 腸球菌分布特征 臨床標本中共分離腸球菌180株，其中屎腸球菌118株(占65.6%)，糞腸球菌46株(占25.6%)，其他腸球菌16株(占8.9%)，包括鶉雞腸球菌8株，鉛黃腸球菌6株和棉子糖腸球菌2株。180株腸球菌分布于不同科室，見表1。180株樣本在各種標本中所占的比例也不同，其中尿液中檢出最多，其次為引流液，其他種類較少，見表2。

表1 180株腸球菌臨床分離株的科室分布(株)

表2 180株腸球菌在臨床標本中的分布[株(%)]

2.2 藥敏試驗結果 對180株腸球菌進行藥敏試驗，觀察其對12種常用抗菌藥物的耐藥情況，結果見表3。

表3 腸球菌分離株對12種抗生素的藥敏率(%)

2.3 腸球菌的多重耐藥性 180株腸球菌中對10種抗菌藥物耐藥的為2例屎腸球菌，占1.1%；對9種抗菌藥物菌耐藥的為10例屎腸球菌，占5.6%；對7種抗菌藥物同時耐藥的菌株所占比例最高，為36.7%(66/180)；其次為耐6種和5種抗菌藥物的菌株，所占比例分別為13.3%(24/180)和11.1%(20/ 180)，見表4。

2.4 耐藥基因檢測結果 118株屎腸球菌陽性耐藥基因檢測結果為：在98株慶大霉素高水平耐藥菌株中，aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的檢出率為95.9%，未檢測到aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因；20株慶大霉素敏感屎腸球菌中6株也檢測到了aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因，檢出率為30.0%。150株對紅霉素耐藥的屎腸球菌中，erm(B)基因的檢出率為66.6%，未檢測到mef(A)基因。126株對四環素耐藥的屎腸球菌中，tet(M)和tet(L)基因的檢出率分別為98.4%和80.9%。34株慶大霉素高水平耐藥菌株中，aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的檢出率為88.2%，未檢測到aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因。38株對紅霉素耐藥的糞腸球菌中，erm(B)基因的檢出率為94.7%，未檢測到mef(A)基因。38株對四環素耐藥的糞腸球菌中，tet(M)和tet(L)基因的檢出率分別為100.0%和52.6%，見表5。16株除屎腸球菌和糞腸球菌以外的腸球菌耐藥基因的檢測結果，見表6。

表4 腸球菌的耐藥種數和構成比(%)

表5 屎腸球菌耐藥菌株和敏感菌株耐藥基因檢出率以及糞腸球菌耐藥基因檢出率

表6 16株其他腸球菌耐藥菌株和敏感菌株耐藥基因檢出率

3 討論

本研究共收集180株腸球菌，來自多個臨床科室，可見腸球菌廣泛分布于醫院環境內。同時，屎腸球菌和糞腸球菌存在于多種不同性質的標本來源中，包括尿液、引流液、肺泡灌洗液、血液、膽汁、腹水、腦脊液等，也進一步證明腸球菌可以在人體不同環境內存在，一定條件下可以導致機體各個部位的感染。180株腸球菌中分離自尿液的最多，占34.4%(62/180)；其次分離于引流液，占25.6%(46/180)；肺泡灌洗液和血液來源的均居第三位，占6.7%(12/180)；腹水來源居第五位，占5.6%(10/180)。由此可推斷，在腸球菌所致的感染中以尿道感染最常見，這與歐陽彬[7]的報道較一致。在所分離的腸球菌中屎腸球菌和糞腸球菌的分離率最高，分別為65.6%(118/180)和25.6%(46/180)，共占總數的91.2%(164/180)，且屎腸球菌的分離率明顯高于糞腸球菌，而成人醫院則以糞腸球菌為主[7-8]。

本研究發現，在檢測的12種抗菌藥物中，屎腸球菌和糞腸球菌的耐藥譜和耐藥率不同。118株屎腸球菌對青霉素、氨芐西林、紅霉素、氨芐西林/舒巴坦、高水平慶大霉素和左氧氟沙星的耐藥率均高于80%；46株糞腸球菌則對四環素、紅霉素和奎奴普丁/達福普汀的耐藥率處于高水平，均高于80%。糞腸球菌對奎奴普丁/達福普汀的耐藥率達87.0%，而屎腸球菌對其的耐藥率僅為10.2%；屎腸球菌對β-內酰胺類抗生素(青霉素、氨芐西林)的耐藥率明顯高于糞腸球菌；未發現對利奈唑胺和萬古霉素耐藥菌株。整體分析，兩種細菌對紅霉素和高水平慶大霉素的耐藥率均高于60%，與李爽等[9]的報道一致，可能與這兩種抗生素作為臨床常用藥在臨床的長期應用密切相關。在這180株樣本中，對7種抗生素同時耐藥的菌株占總數的36.7%(66/180)，其次為同時耐受6種和5種抗生素的菌株，所占比例分別為13.3%(24/180)和11.1%(20/180)。總體分析180株樣本，對4種及以上抗生素同時耐藥的菌株高達84.5%(152/180)，提示應加強措施控制多重耐藥腸球菌的蔓延。

近年來關于腸球菌耐藥基因的檢測或耐藥基因作用機制的研究較多，不同來源，不同種屬的腸球菌在耐藥基因的檢出率上存在較大的差異，這可能與地區、人群或標本等的構成不同有關。本研究得到耐高濃度慶大霉素(HLGR)菌株140株，在這些菌株中aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的檢出率為92.8%。而在180株腸球菌中均未檢出aph(2'')-Ib、aph(2'')-Ic或aph(2'')-Id基因，提示aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因的存在是導致HLGR發生的主要原因，這與其他國內研究結果相一致[10]。有10株HLGR未能檢測到以上四種氨基糖苷類耐藥基因，提示其耐藥機制可能由其他耐藥基因介導。150株對紅霉素耐藥腸球菌中，erm(B)基因的檢出率為66.6%，未檢測到mefA基因，提示腸球菌對紅霉素的耐藥性可能主要由erm(B)基因介導，且糞腸球菌中erm(B)的檢出率(94.7%)明顯高于屎腸球菌(60.0%)。126株四環素耐藥腸球菌中，tet(M)基因陽性率為98.4%，tet(L)基因陽性率為80.9%；在38株耐四環素的糞腸球菌中，tet(M)基因的檢出率為100.0%，可見四環素藥敏表型與tet(M)基因型在糞腸球菌中有很高的符合率，而tet(L)基因的檢出率僅為52.63%(20/38)；在80株耐四環素的屎腸球菌中，tet(M)基因型與tet(L)基因型與四環素藥敏表型的符合率分別為97.5%(78/80)和92.5%(74/80)，同樣處于較高水平。值得提及的是，在28株對高水平慶大霉素敏感的腸球菌中，有8株檢測出攜帶有aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia基因；同樣，在38株對四環素敏感的屎腸球菌中，分別由4株和6株攜帶有tet(M)基因和tet(L)基因。這種表型與基因型不一致可能為基因突變或基因的表達受抑制所致，其內在機制需進一步討論研究。

綜上所述，腸球菌是兒童院內感染的常見病原菌，以屎腸球菌為主，且主要為尿路感染。腸球菌多重耐藥情況嚴重，同一菌株攜帶多種耐藥基因的頻率較高，警示我們要合理使用抗菌藥物，減少細菌耐藥。

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Clinical epidemiology and antibiotic resistant genes of multidrug-resistant Enterococcus isolated from infected children.

ZHANG Shu-wan1,HUANG Jun-hua2.1.Department of Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi’an 710003,Shaanxi,CHINA;2.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi, CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical epidemiological trend and antibiotic resistant pattern of Enterococci isolated from infected children in order to guide the rational use of antibiotics and effective surveillance of nosocomial infections.MethodsOne hundred and eighty strains of Enterococci isolated from infected children in Xi'an Children's Hospital from February 2014 to January 2015 were collected and analyzed for epidemiological distribution and antibiotic susceptibility profile by K-B Method.Multiplex polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the resistance genes for gentamycin[aac(6')-Ie-aph9(2'')-Ia,aph(2'')-Ib,aph(2'')-Ic,aph(2'')-Id],erythromycin[erm (B),mef(A)],tetracycline[tet(M),tet(L)].ResultsAmong the 180 isolates,which were mainly from urine(34.4%), there were 118 strains ofEnterococcus faecium,46 strains ofE.faecalisand 16 strains ofEnterococci spp(8.9%).Antibiotic susceptibility of Enterococci against 12 antibiotics was determined by K-B method.High-level gentamycin resistance(HLGR)was present in 83.0%ofE.faeciumand 73.9%ofE.faecalisisolates.Resistance to erythromycin and tetracycline was highly prevalent inE.faecium(84.7%and 67.8%,respectively)andE.faecalis(82.7%and 82.6%,respectively).Among the 140 HLGR isolates,the most prevalent resistant determinant was aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia (92.9%),while none of the isolates harboredaph(2'')-Ib,aph(2'')-Ic oraph(2'')-Id.The erm(B)gene was responsible for erythromycin resistance in 66.6%of the erythromycin resistant enterococcal isolates,while other erythromycin resistant genes were not detected.Thetet(M)andtet(L)genes were successfully amplified from 98.4%and 80.9%of tetracycline resistant isolates,respectively.There was no linezolid and vancomycin resistance.ConclusionEnterococci are important nosocomial pathogens withE.faeciumandE.faecalisspecies most commonly isolated from clinical specimens in children.Urinary tract infection is the most common infection of Enterococcus for children.HLGR has become the important antibiotic resistance bacteria,which results in nosocomial infection,and theaac(6')-Ie-aph(2")-Ia gene is the main aminoglycoside-modifying enzyme gene which causes HLGR.erm(B)is the most prevalent genotype in the erythromycin resistant isolates,while harbouringtet(M)andtet(L)is the cause of tetracycline resistance.

Children;Enterococcus;Epidemiology;Multidrug resistance;Resistance genes

R725.7

A

1003—6350（2015）17—2554—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0925

2015-03-01)

張書婉。E-mail：shuwan0103@163.com