rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠急性腎損傷的保護作用

周忠義，謝曉紅，吳遠怡，田 佳，魏曉芬

(海南省人民醫院重癥醫學科，海南 海口 570311)

rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠急性腎損傷的保護作用

周忠義，謝曉紅，吳遠怡，田 佳，魏曉芬

(海南省人民醫院重癥醫學科，海南 海口 570311)

目的 探討重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)對盲腸結扎穿孔術(CLP)+檢驗性失血大鼠急性腎損傷的保護作用。方法160只SD大鼠CLP術后按照隨機數表法取均分為四組(對照組、小劑量組、中劑量組和大劑量組)，每組各40只，四組均關腹后0 h、24 h、48 h尾靜脈放血1 ml，小劑量組0 h皮下注射3 000 U/kg+生理鹽水1 ml(24 h、48 h皮下注射生理鹽水1 ml)，中劑量組0 h、24 h皮下注射rHuEPO 3 000 U/kg+生理鹽水1 ml(48 h皮下注射生理鹽水1 ml)，大劑量組0 h、24 h、48 h皮下注射3 000 U/kg+生理鹽水1 ml，對照組0 h、24 h、48 h皮下注射生理鹽水1 ml，分籠飼養，72 h每組各取5只經心臟取血2 ml，檢測血紅蛋白(Hb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、腫瘤壞死因子(TNF-α)，檢測腎臟丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶活性(MPO)、核轉錄因子(NF-κB)表達和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口標記(TUNEL)陽性細胞數。結果大中劑量組BUN、Cr、TNF-α、MDA、MPO、NF-κB、TUNEL陽性細胞數分別與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，大劑量組較中劑量組差異有統計學意義(P＜0.05)，而小劑量組上述指標分別與對照組比較差異則均無統計學意義(P＞0.05)，四組的Hb比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結論rHuEPO能夠降低盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血所致急性腎損傷大鼠TNF-α、MDA、MPO、NF-κB表達和TUNEL陽性細胞數，對膿毒癥和檢驗性失血雙重打擊急性腎功能損傷具有一定的保護作用，且呈劑量依賴性。

重組人促紅細胞生成素；盲腸結扎穿孔術；檢驗性失血；急性腎損傷

膿毒癥是重癥醫學科(ICU)內患者的主要死亡原因之一，膿毒癥合并急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)的發生率為19%～23%[1]。抽血行實驗室檢測是住院患者的常規措施，危重患者更是需要頻繁地抽血化驗以協助診斷和指導治療。檢驗性失血加重組織器官缺氧，使危重患者雪上加霜，增加病死率和醫療費用，影響預后[2-3]。膿毒癥+檢驗性失血已成ICU中常見的合并癥。本實驗擬探討重組人紅細胞生成素(Recombinant human erythropoietin，rHuEPO)對膿毒癥+檢驗性失血大鼠急性腎損傷有無保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠160只，體重250～280 g，由海南醫學院動物實驗室提供。所有動物均自由覓食和覓水。

1.2 實驗方法 所有動物實驗前夜禁食，自由飲水。10%水合氯醛(0.3/kg體重)腹腔注射麻醉，腹部正中線切開腹壁進入腹腔，在盲腸中段50%處結扎并用9#針頭在盲腸結扎的遠端中間位置全層穿透，并輕擠出少許糞便以保證穿孔處的開放性。盲腸放回腹腔，連續縫合關腹。各組均于術畢皮下注射生理鹽水30 ml/kg，以補充術中液體的丟失。所有動物手術在10 min之內完成，保持一致性，術后分籠飼養。術后按照隨機數字表法均分為四組(對照組、小劑量組、中劑量組和大劑量組)，每組各40只，四組均關腹后0 h、24 h、48 h尾靜脈放血1 ml，小劑量組0 h皮下注射3 000 U/kg+生理鹽水1 ml(24 h、48 h皮下注射生理鹽水1 ml)，中劑量組0 h、24 h皮下注射3 000 U/kg+生理鹽水1 ml(48 h皮下注射生理鹽水1 ml)、大劑量組0 h、24 h、48 h皮下注射rHuEPO 3 000 U/kg+生理鹽水1 ml對照組0 h、24 h、48 h皮下注射生理鹽水1 ml，分籠飼養，72 h后每組各取5只經心臟取血2 ml，檢測血紅蛋白(Hb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、腫瘤壞死因子(TNF-α)，檢測腎臟丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶活性MPO、核轉錄因子(NF-κB)表達和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口標記(TUNEL)陽性細胞數。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較用成組t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠BUN和Cr的影響 小劑量組大鼠的BUN、Cr與對照組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，中大劑量組BUN、Cr與對照組和小劑量組比較明顯下降，大劑量組又比中劑量組明顯下降，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 72 h后不同劑量rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠BUN和Cr的影響(±s)

表1 72 h后不同劑量rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠BUN和Cr的影響(±s)

注：與對照組比較，aP＞0.05；與對照組比較，bP＜0.05；與小劑量組比較，cP＜0.05，與中劑量組比較，dP＜0.05。

組別Cr(μmol/L)BUN(mmol/L)對照組(n=40)小劑量組(n=40)中劑量組(n=40)大劑量組(n=40)89.385±6.182 86.960±6.885a70.115±7.031bc61.308±6.007bcd29.612±6.310 28.372±7.042a17.932±5.309bc11.073±4.607bcd

2.2 rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠TNF-α、腎臟NF-κB、MPO、MDA、TUNEL細胞凋亡的影響 小劑量組血清中TNF-α及腎臟NF-κB、MPO、MDA、TUNEL數目與對照組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，中大劑量組血清中TNF-α及腎臟NF-κB、MPO、MDA、TUNEL數目與對照組和小劑量組比較明顯下降，大劑量組又比中劑量組明顯下降，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 72 h后rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠TNF-α、腎臟NF-κB、MPO、MDA、TUNEL細胞凋亡的影響(±s)

表2 72 h后rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠TNF-α、腎臟NF-κB、MPO、MDA、TUNEL細胞凋亡的影響(±s)

注：與對照組比較，aP＞0.05；與對照組比較bP＜0.05；與小劑量組比較，cP＜0.05；與中劑量組比較，dP＜0.05。

組別對照組(n=40)小劑量組(n=40)中劑量組(n=40)大劑量組(n=40)TNF-α(pg/ml)90.503±4.30 89.141±4.52a76.503±4.38bc68.033±3.79bcdNF-κB(IOD)20397.079±3217.869 19515.326±4112.805a15042.572±2206.773bc12150.746±1215.906bcdMPO(U/g)2.11±0.12 1.95±0.37a1.05±0.23bc0.54±0.13bcdMDA(nmol/mg)16.56±4.46 15.82±3.62a11.79±2.05bc8.03±1.92bcdTUNEL 0.779±0.039 0.763±0.211a0.604±0.083bc0.516±0.112bcd

2.3 rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠Hb的影響 四組血清中Hb變化不明顯[對照組Hb(97.7±6.7)g/L，小劑量組(98.7±5.9)g/L，中劑量組(100.4±6.2)g/L，大劑量組(101.5±7.4)g/L]，差異均無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

膿毒癥是感染導致的全身性炎癥反應綜合征，可進展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征，是危重病患者常見的死亡原因之一[4]。危重病患者因為器官受損、內環境紊亂，病情危重，臨床上為了及時協助診斷、嚴密監測病情、指導治療和判斷預后，需要頻繁抽血檢驗，由此造成的檢驗性失血在所難免。失血會導致血液攜氧能力下降，難以滿足危重病患者高分解代謝狀態的氧需求，它更加加重了組織器官缺氧，明顯降低患者的免疫力，誘發器官損傷，增加心血管、呼吸系統的應激性和相關疾病的發生率，嚴重影響患者的預后。檢驗性失血使靜脈輸血的需求增加，與輸血相關的副作用和并發癥也增多，從而使住院時間延長，病死率增高，醫療費用增加。在臨床實踐中發現，膿毒癥一旦合并腎臟損害，治療難度明顯增加，急性腎損傷已被視為膿毒癥的獨立死亡因素。研究膿毒癥急性腎損傷合并檢驗性失血的治療有重要臨床意義。

促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)是由腎臟及胚胎的肝臟產生的一種含酸性糖蛋白，血液中的EPO由165個氨基酸殘基構成。1985年促紅細胞生成素的分子產物克隆成功，之后利用基因重組技術大批量生產重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)，并廣泛應用于臨床。在rHuEPO的臨床應用過程中，主要是作為一種調節紅細胞生成的生長刺激因子在使用，用于治療貧血。近年研究發現促紅細胞生成素受體(EPOR)也可以同時在中樞神經系統、肺、腎臟、胃腸道、視網膜、心臟等器官表達，而且還發現，EPO除了具有調節紅細胞生成的功能外還具有抵抗炎癥、抗凋亡、促進血管生成、抗氧化應激等一些造血以外的功能[5]。Kumral等[6]認為，EPO在炎癥反應過程中具有類似類固醇樣的抗炎作用，可抑制炎性細胞的浸潤和前炎性因子的表達。Tsao等[7]證明EPO可以降低膿毒癥大鼠血清中IL-6的水平和肺組織iNOS的表達，對膿毒癥急性肺損傷有保護作用。Soiling等[8]證明EPO可以調節炎癥反應改善膿毒癥引起的腎臟血流動力學障礙，降低膿毒癥大鼠血清中IL-10、TNF-α的水平，對膿毒癥急性腎損傷有保護作用。

本研究觀察到重組人促紅細胞生成素干預治療明顯減少盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠72 h后BUN、Cr，證實rHuEPO對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠急性腎損傷具有保護作用。進一步研究發現大中小劑量組較對照組大鼠Hb上升，但差異無統計學意義(P＞0.05)，提示這種方法的重組人促紅細胞生成素干預不能改善盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠的貧血狀態，說明rHuEPO對急性腎損傷的保護作用與貧血改善之間無必然聯系。

膿毒癥所致多器官功能障礙綜合征是機體炎癥反應失控的結果，其核心是全身炎癥反應與代償性抗炎反應失衡[9]。膿毒癥早期腎組織細胞凋亡數量增加，腎組織細胞的凋亡與細胞因子大量釋放等因素有關；同時腎缺血再灌注(I/R)損傷又加速了腎組織細胞凋亡的發生[10]。目前認為膿毒癥腎損傷發病機制與血流動力學的變化、內毒素與炎性介質、細胞凋亡等因素有關[11]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是細胞因子中最早出現的最主要的一種，它啟動后續的一系列病理生理改變來參與炎癥反應。核轉錄因子(NF-κB)是細胞內重要的核轉錄因子，啟動和調控多種炎癥因子的基因轉錄，其激活可觸發炎性因子的“瀑布樣級聯反應”和促進細胞凋亡，介導膿毒癥多器官功能損傷。TNF-α、NF-κB是常用的評價機體炎癥反應程度和治療效果的指標之一[12]。氧化應激反應是因為機體活性氧產生太多，超過了機體抗氧化物質的清除能力引起組織細胞損害的一種應激反應。丙二醛(MDA)為一種脂質過氧化產物，它的變化可以間接反應過脂質過氧化反應程度。髓過氧化物酶活性(MPO)是中性粒細胞在組織中浸潤的一個生化標記，可以反映炎癥損傷的程度。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口標記(TUNEL)陽性細胞數反映細胞凋亡。腎是分泌EPO的主要器官，有EPOR表達。有學者研究認為rHuEPO與腎EPOR結合后通過各種信號途徑可抑制炎性反應，減輕超氧損傷，減少細胞凋亡和壞死，減輕內皮損害、腎血管球硬化和小管間質性損傷而發揮腎保護作用[13-14]。本研究發現應用rHuEPO處理使得盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血急性腎損傷大鼠TNF-α、NF-κB、MDA、MPO、TUNEL陽性細胞數下降，劑量越大效果越明顯，說明rHuEPO通過減輕氧化應激及炎癥因子釋放抑制全身炎癥反應和減少細胞凋亡對急性腎損傷起保護作用。

綜上所述，我們認為，rHuEPO通過調節NF-κB的表達，降低TNF-α水平，減輕氧化應激抑制全身炎癥反應和減少細胞凋亡對盲腸結扎穿孔術+檢驗性失血大鼠急性腎損傷起保護作用。

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Protective effects of recombinant human erythropoietin in rats with acute kidney injury under cecal ligation and puncture and blood loss during laboratory test.

ZHOU Zhong-yi,XIE Xiao-hong,WU Yuan-yi,TIAN Jia,WEI Xiao-fen.Intensive Care Unit,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the protective effects of recombinant human erythropoietin(rHuEPO)in rats with acute kidney injury under cecal ligation and puncture(CLP)and blood loss during laboratory test.MethodsOne hundred and sixty SD rats were averaged into four groups(control group,low-dose rHuEPO group,median-dose rHuEPO group and high-dose rHuEPO group)through the random number table after CLP.1 ml of tail vein blood each was taken 0 h,24 h,48 h after the abdomen closure.rHuEPO 3 000 U/kg+saline 1 ml was injected subcutaneously in low-dose rHuEPO group at the time of 0 h,and 1 ml of saline was injected respectively at 24 h and 48 h. rHuEPO 3 000 U/kg+saline 1 ml was injected subcutaneously in median-dose rHuEPO group at the time of 0 h and 24 h, and 1 ml of saline was injected at 48 h.rHuEPO 3 000 U/kg+saline 1 ml was injected subcutaneously in high-dose rHuEPO group at the time of 0 h,24 h and 48 h.The control group was injected with normal saline 1 ml each at the time of 0 h,24 h and 48 h.Rats were separated in different cages for 72 h,then 5 out of each group were selected and drew 2 ml of blood each from the hearts to test hemoglobin hemoglobin(Hb),urea nitrogen(BUN),creatinine(Cr),tumor necrosis factorα(TNF-α),as well as the expression of malonaldehyde(MDA),myeloperoxidase(MPO)and nuclear factor-κB(NF-κB)in their kidneys,and also,the amount of terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)positive cells.ResultsThe median-dose rHuEPO and high-dose rHuEPO group showed statistically significant differences respectively with the control group in the test results of BUN,Cr, TNF-α,MDA,MPO,NF-κB and TUNEL positive cells(P＜0.05).The differences in the above indexes between the high-dose rHuEPO group and the median-dose rHuEPO group were statistically significant(P＜0.05),while the differences between the low-dose rHuEPO group and the control group was not different(P＞0.05).The four groups showed no statistically significant difference from each other inHb(P＞0.05).ConclusionrHuEPO could decrease the expres-sion of MDA,MPO,NF-κB and the TUNEL positive cells in the rats with acute kidney injury under the circumstances of CLP and blood loss during laboratory test.It has a certain extent of protective effects for the acute kidney injury caused by sepsis and blood loss during laboratory test,which also demonstrates a feature of dose-dependence.

Recombinant human erythropoietin(rHuEPO);Cecal ligation and puncture;Blood loss during laboratory test;Acute kidney injury

R-332

A

1003—6350（2015）17—2503—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0908

2015-04-14)

海南省衛生廳科研立項課題(編號：瓊衛2012PT—02)

周忠義。E-mail：adslzhouzy@sina.com