延邊豬巴氏桿菌的分離與鑒定

摘要：本文對近年來引起延邊豬突然死亡的主要病毒進行分離鑒定，進而為疫苗的研發奠定基礎，通過對致病細菌培養、細菌形態學觀察、細菌培養特性鑒定、細菌生化鑒定、動物接種以及藥敏試驗的方法對延邊豬巴氏桿進行分離培養與鑒定。試驗結果表明該病菌于厭氧條件在兔鮮血瓊脂平板生長狀態良好；革蘭氏染色呈陽性，鏡檢呈圓形、鏈狀；甲基紅試驗呈紅色；能夠產生H2S氣體；藥敏試驗該菌株對阿莫西林和先鋒V高度敏感。從疑似發生延邊豬巴氏桿菌病患豬的肺臟和淋巴結中可以分離到巴氏桿菌。

關鍵詞：巴氏桿菌；分離；鑒定

中圖分類號： S852 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2015.06.036

巴氏桿菌的種類繁多，在自然界分布很廣，呈圓形或橢圓形排列成長短不一的鏈，其易感動物較多，動物巴氏桿菌病中以豬、牛、羊、馬較常見。近年來，水貂、魚、兔、熊也有發生巴氏桿菌病的報道。巴氏桿菌病是由β溶血性巴氏桿菌引起的多種人獸共患病的總稱。根據患病豬的臨床癥狀和發病機理不同，可以看出它是感染的巴氏桿菌的種類不一樣，所以分為腦膜炎型、關節腫脹型、化膿性淤血淋巴結炎型，還有敗血癥型[1]。隨著經濟發展，人們對養殖業的熱衷，延邊豬患有巴氏桿菌病死亡數也在增加。2014年3月，吉林省某養殖場延邊豬死亡，延邊豬由于疾病導致死亡的問題引起大家的重視，所以本實驗通過細菌培養、細菌形態學觀察、細菌培養特性鑒定、細菌生化鑒定、動物接種以及藥敏試驗的方法對延邊豬巴氏桿菌進行分離與鑒定。

1材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物

麥康凱瓊脂平板、血瓊脂平板和普通瓊脂平板均自行配制；革蘭氏染色試劑和藥敏試紙購自福州富利達生物實驗制品有限公司，生化試劑購自廣東環凱微生物科技有限公司；小鼠購自長春。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 將患病解剖，觀察，取樣，然后將豬的脾、肺淋巴結等組織進行劃線，接種于血清LB平板做細菌分離培養和組織觸片檢查，置37 ℃厭氧培養20～24小時后在試驗臺上觀察結果，挑取多個單個被懷疑是巴氏桿菌的菌落做純凈的培養。

1.2.2 單個細菌形態外貌及生長特性的觀察 將上述已經分離純化生長非常好的單個菌株一類接種于普通瓊脂平板，另一類接種于麥康凱瓊脂平板，將它們分別置于37℃有氧和無氧條件下進行單獨培養，然后觀察他們的生長表現和形態狀況等[2]。與此同時對這些菌株的溫度、時間、培養的環境、營養需求分別與空白組進行對比試驗[3]。然后挑取液體和固體培養基中的菌進行涂片，染色，鏡檢及進一步觀察。

1.2.3 細菌生化鑒定 根據生化鑒定使用說明書，按照步驟將細菌分別接種到葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇生化鑒定管中，37 ℃培養8～24小時后觀察結果。做甲基紅實驗、硫化氫（H2S）實驗、過氧化酶實驗鑒定巴氏桿菌。

1.2.4動物接種試驗 隨機選用無菌飼養小鼠8只，設置試驗組和對照組，各4只。試驗組，分別在小鼠腹腔接種不同梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4）菌液0.5毫升，對照組用滅菌生理鹽水代替。并將兩組小鼠在相同的環境條件，隔離觀察飼養，24小時后觀察小鼠發病或死亡的表現，同時剖檢致病小鼠，取小鼠內臟進行病原菌的分離培養鑒定與分析。藥敏試驗操作步驟按常規試紙片法進行。

2 結果

2.1 細菌形態學觀察

從小鼠的脾臟中分離得到1 株病原菌，在兔鮮血瓊脂平板上厭氧培養18～24小時后進行觀察，菌落呈現針尖大小、橢圓形或圓形、局部有隆起、邊緣整齊，顏色為灰白色或微灰色；呈革蘭氏染色陽性，顯微鏡下呈圓形的鏈條形狀菌體。

2.2 細菌培養特征鑒定

鑒定結果表明，該菌在麥康凱瓊脂平板上置于厭氧和有氧條件下均不生長，在普通瓊脂平板上幾乎無菌體生長，在有兔鮮血瓊脂平板置于厭氧環境培養時，生長狀態良好，置于有氧條件下生長狀態不好。挑取單個生長菌落分別進行涂片觀察，結果顯示，革蘭氏染色后鏡檢，均呈陽性、圓形或橢圓形，長、短鏈形狀呈現不均一排列。

2.3 細菌生化鑒定

接種7種生化試劑后發現，該菌不發酵乳糖、葡萄糖、鼠李糖，發酵麥芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇。

甲基紅實驗，使用甲基紅試劑，培養液變成紅色。

硫化氫（H2S），使用實驗醋酸鉛斜面培養基，在穿刺線周圍出現黑色。

過氧化酶實驗，使用H2O2，有氣泡產生。

2.4動物實驗病原菌

接種小鼠后，小鼠出現了不同程度的抑郁，食欲不振，精神萎靡等癥狀， 12小時過后小鼠全部死亡，然后對小鼠剖檢，觀察到肝臟明顯肥大。

2.5藥敏試驗

該試驗結果進一步表明，分離菌株對阿莫西林和先鋒V 藥物高度敏感，而對菌必治、呋喃妥因、慶大霉素和磺胺類藥中度敏感，對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、蒽諾沙星、復方新諾明、環丙沙星不敏感。

3 討論

依據菌體感染小鼠內臟的分析與鑒定結果，以及延邊豬場近期該病的感染狀況等，最終將該豬場發生的疫病定為巴氏桿菌感染。該致病菌在有氧和厭氧條件下，在麥康凱瓊脂平板上均不生長，在普通瓊脂平板上生長極少，而在厭氧比有氧條件下，在鮮血瓊脂平板上生長狀態非常好。挑取單個生長菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢，均呈巴氏桿菌陽性，形態呈圓形，并呈長短鏈狀排列。

分離獲得的菌株對先鋒V和阿莫西林均高度敏感，對呋喃妥因、磺胺類藥和菌必治等中度敏感，對復方新諾明、鏈霉素、青霉素、卡那霉素、環丙沙星類藥物等極不敏感。

對于此現象，要加強管理，及時消毒，全面做好免疫工作，做好疾病防控。

參考文獻

[1] 陳溥言.獸醫傳染病學[M].北京：中國農業出版社，2006：155-162.

[2] 陸承平.獸醫微生物學[M]北京：中國農業出版社，2007.

[3] 倪宏波， 王興龍.長春地區豬巴氏桿菌分離株的病原特性研究[ J] .黑龍江八一農墾大學學報， 2002， 14（1）：64-76.

作者簡介：張闖，碩士，延邊大學農學院獸醫預防實驗室，研究方向：動物傳染病分子生物學。endprint