液質(zhì)聯(lián)用法篩選黃芩中清除自由基的活性物質(zhì)

劉淵宏，宋 龍

(1.甘肅奇正藏藥有限公司，蘭州 730000;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203)

液質(zhì)聯(lián)用法篩選黃芩中清除自由基的活性物質(zhì)

劉淵宏1，宋 龍2△

(1.甘肅奇正藏藥有限公司，蘭州 730000;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203)

目的:用液質(zhì)聯(lián)用方法快速篩選黃芩藥材中用于清除人體內(nèi)自由基的活性物質(zhì)。方法:通過(guò)對(duì)黃芩中提取制得含4種單體(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)的樣品溶液，分別與各自由基制得的溶液混合，以甲醇為對(duì)照孵化培養(yǎng)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)黃芩提取液中各組分分離，以峰面積的變化來(lái)進(jìn)行考察。結(jié)果:清除自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這4種成分經(jīng)過(guò)與超氧自由基、羥基自由基、過(guò)氧自由基反應(yīng)后含量都有不同程度的減少。結(jié)論:黃芩中4種成分對(duì)DPPH、超氧自由基、羥基自由基和過(guò)氧自由基都具有一定的清除作用。

自由基;黃芩;液質(zhì)聯(lián)用

自由基是導(dǎo)致人體衰老、癌癥的主要誘因，為近代科學(xué)研究所重視。在人體自由基中，活性氧(ROS)占到自由基總量的95%，其中人體內(nèi)重要的活性氧自由基包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基被認(rèn)為是抗自由基活性物質(zhì)清除自由基性能的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)［1-2］。為防治自由基對(duì)人體產(chǎn)生的危害，抗自由基物質(zhì)開(kāi)發(fā)成為科學(xué)研究的重點(diǎn)。在生物尤其植物中存在著大量的天然抗自由基化合物，其副作用很低、種類多且易于應(yīng)用，成為抗自由基物質(zhì)開(kāi)發(fā)的重要方向［3-5］。

天然產(chǎn)物中黃酮類物質(zhì)對(duì)自由基有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。黃芩作為傳統(tǒng)中藥，目前已被列入世界眾多國(guó)家的藥典，如中國(guó)、韓國(guó)、日本等。其主要活性成分即為黃酮類成分，如黃芩苷、黃芩素等，且這些成分的抗氧化、抗自由基作用也受到科學(xué)研究的重視。與此同時(shí)，黃芩地上部分(莖葉)中黃酮類物質(zhì)以野黃芩苷、野黃芩素為主，具有抗氧化、抗自由基的作用。但這4種成分對(duì)人體內(nèi)重要自由基清除活性，卻未得到深入研究。

抗自由基物質(zhì)評(píng)價(jià)主要有體外評(píng)價(jià)和體內(nèi)評(píng)價(jià)，體外評(píng)價(jià)如ABTS自由基陽(yáng)離子清除實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)、羥自由基清除實(shí)驗(yàn)、脂氧自由基清除實(shí)驗(yàn)等［6-7］;體內(nèi)評(píng)價(jià)常采用小鼠或大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定結(jié)果能夠真實(shí)反映抗自由基物質(zhì)在生物體內(nèi)的清除活性，但由于檢測(cè)指標(biāo)多而復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴等原因，并不適合抗自由基物質(zhì)的前期篩選。

為深入研究黃芩中的抗自由基活性，本文采用體外自由基評(píng)價(jià)方法，就黃芩中所含野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素等4種成分對(duì)人體內(nèi)氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基的清除作用進(jìn)行研究，為黃芩抗自由基物質(zhì)的前期篩選開(kāi)發(fā)研究提供重要的理論支撐。

1 儀器與材料

HH-S4電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;YLD-6000 SHP生化培養(yǎng)箱，揚(yáng)州鴻都電子有限公司;AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;Surveyor高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，美國(guó)Finnigan。

黃芩莖葉購(gòu)自陜西西安，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥全草。對(duì)照品為野黃芩苷，含量98%，阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司;Free Radical DPPH購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(St.Louis，MO，USA);其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 提取物制備

準(zhǔn)確稱取黃芩地上部分6.60 g，采用熱回流法，加入350 mL甲醇，60℃提取4 h。在提取液中，按提取液中野黃芩苷含量為2%，等質(zhì)量添加野黃芩素;按黃芩苷含量為8%，等質(zhì)量添加黃芩素，制備為P (primary)液。

野黃芩素、黃芩素為實(shí)驗(yàn)室自制。取野黃芩苷(或者黃芩苷)3.0 g，依次加入120 mL70%乙醇、20 mL濃硫酸，110℃加熱6 h，攪拌速率10 r/s。反應(yīng)結(jié)束后，加入6倍體積量純水，過(guò)濾并收集濾餅即為野黃芩素(或者黃芩素)。

2.2 色譜總離子HPLC

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化中分別采用乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-甲酸-水。通過(guò)圖譜的對(duì)比分析得出，在流動(dòng)相為乙腈、甲酸和水的條件下，采用全梯度洗脫模式能夠達(dá)到最優(yōu)的分離度和選擇性，優(yōu)化的梯度洗脫條件如下(乙腈:A，0.5%甲酸水:B):0 min，A:3%，B:97%;23 min，A:10%，B:90%;40 min，A:46%，B:54%;60 min，A:100%。流速控制在0.2 ml/min，考慮分離效率的同時(shí)，兼顧色譜柱的柱填料(3 mm)和兼容后期的液質(zhì)聯(lián)用分析。

液相色譜分析采用 Thermo Finnigan Surveyor HPLC系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)優(yōu)化后，為在分離過(guò)程獲得更好的選擇性、分離度、靈敏度和重復(fù)性，最終確定采用色譜柱為 Thermo Hypersil GOLD C18(3 mm，150×2.1 mm，i.d.，鍵合雜化填料)的反相柱，柱溫設(shè)定為40℃;數(shù)據(jù)以3D波長(zhǎng)采集，波長(zhǎng)范圍在190～800 nm全波長(zhǎng)掃描，PDA/UV檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。進(jìn)樣方式采用自動(dòng)進(jìn)樣，部分定量環(huán)進(jìn)樣模式(Partial loop)，進(jìn)樣量2 μL;進(jìn)樣室溫度4℃。

2.2.2 總離子色譜圖 量取P液經(jīng)0.45 um過(guò)濾器過(guò)濾其雜質(zhì)，進(jìn)樣經(jīng)HPLC分析得出其全程譜圖。經(jīng)色譜指認(rèn)，其中A峰為野黃芩苷，B峰為野黃芩素，C峰為黃芩苷，D峰為黃芩素。

2.3 自由基制備

2.3.1 DPPH的制備 精確稱取 0.0035 gDPPH，用無(wú)水甲醇溶解定容至50 ml容量瓶中標(biāo)為A液，儲(chǔ)存于0～4℃冰箱中備用。

2.3.2 超氧自由基的制備 精確稱取0.0100 g核黃素用70%甲醇溶解定容至10 ml容量瓶中標(biāo)為B液;取0.0250 g甲硫氨酸溶解定容于25 ml容量瓶中標(biāo)為C液，以上制備液儲(chǔ)存于0～4℃冰箱中備用。

2.3.3 過(guò)氧自由基制備 精確稱取0.3025 g卵磷脂溶于30 ml磷酸鹽緩沖液中(50 mmol/L，pH =7.4)并超聲，冰水浴保持2 h，標(biāo)為E液;準(zhǔn)確稱取0.0148 g氯化鐵，定容至50 mL，標(biāo)為F液;準(zhǔn)確稱取0.0107 g抗壞血酸，定容至50 mL，標(biāo)為H液，以上制備液儲(chǔ)存于0～4℃冰箱中，備用。

2.3.4 羥基自由基的制備 精確稱取0.0414 g水楊酸定容至50 mL，標(biāo)為I液;準(zhǔn)確稱取0.3006 g七水硫酸亞鐵晶體，定容至100 mL，標(biāo)為J液;精確稱取0.0564 g過(guò)氧化氫溶液，定容至50 mL，標(biāo)為K液，以上制備液儲(chǔ)存于0～4℃冰箱中備用。

2.4 自由基測(cè)定

2.4.1 DPPH清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取2.5 mLP液和2.5mLA液混勻，37℃恒溫避光孵化2 h;對(duì)照組準(zhǔn)確量取2.5 mLP液和2.5 mL甲醇混勻，37℃恒溫避光孵化2 h。

2.4.2 超氧自由基清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取2.0 mlP液、1.0 mLB液、1.0 mLC液混勻，在254 nm和365 nm紫外燈下避光孵化2 h;對(duì)照組準(zhǔn)確量取2.0 mlP液和2.0 mL甲醇混勻，在254 nm和365 nm紫外燈下避光孵化2 h。

2.4.3 過(guò)氧自由基清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取1.0 mLP液、5.0 mLE液、2.0 mLF液、1.0 mlH液混勻，37℃恒溫避光孵化4 h;對(duì)照組準(zhǔn)確量取1.0 mLP液、5.0 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH= 7.4)、2.0 mLF液、1.0 mlH液混勻，37℃恒溫避光孵化4 h。

2.4.4 羥基自由基清除率 實(shí)驗(yàn)組準(zhǔn)確量取5.0 mLP液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、2.0 mLK液，依次加入混勻，37℃恒溫避光孵化2 h。對(duì)照組準(zhǔn)確量取5.0 mLP液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、2.0 mL去離子水依次加入混勻，37℃恒溫避光孵化2 h。自由基清除率計(jì)算公式:對(duì)于一個(gè)自由基實(shí)驗(yàn)體系，通過(guò)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)應(yīng)譜峰面積的變化，就可以利用計(jì)算公式來(lái)評(píng)價(jià)相應(yīng)組分的清除自由基活性，其計(jì)算公式如下:100%。其中PAcontrol是對(duì)照組的峰面積，PAexp是實(shí)驗(yàn)組的峰面積。

2.5 色譜圖中組分物質(zhì)的鑒定

不同自由基評(píng)價(jià)色譜圖中4種成分(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)的鑒定，是對(duì)比4種物質(zhì)各自的保留時(shí)間、UV光譜數(shù)據(jù)、MS以及MS2數(shù)據(jù)，并通過(guò)對(duì)各自物質(zhì)的裂解規(guī)律討論進(jìn)行驗(yàn)證，并參考相關(guān)文獻(xiàn)［4-22］。

3 結(jié)果與討論

3.1 超氧自由基的評(píng)價(jià)

圖1顯示，峰1表示野黃芩苷，峰2表示野黃芩素，峰3表示黃芩素，自由基色譜數(shù)據(jù)。

3.2 羥基自由基評(píng)價(jià)

圖2表2顯示，4種成分(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)對(duì)超氧自由基、羥基自由基、過(guò)氧自由基具有一定的清除作用。比較而言，4種成分對(duì)3種自由基總體效果為:過(guò)氧自由基＞羥基自由基＞超氧自由基。這種效果排序驗(yàn)證了前人對(duì)黃芩提取物藥理作用的研究，也驗(yàn)證了黃芩全草提取物在擴(kuò)張血管、改善血液微循環(huán)、提高供血水平方面的應(yīng)用。

圖1 超氧自由基活性分子篩選前后對(duì)照?qǐng)D

表1 超氧自由基活性分子篩選數(shù)據(jù)分析

表2 羥基自由基活性分子篩選數(shù)據(jù)分析

圖2 羥基自由基活性分子篩選前后對(duì)照?qǐng)D

由清除超氧自由基實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分析數(shù)據(jù)及譜圖可知，經(jīng)測(cè)定野黃芩苷對(duì)超氧自由基的清除率18.98%，黃芩苷對(duì)超氧自由基的清除率1.09%，黃芩素對(duì)超氧自由基的清除率24.38%，其他成分無(wú)表觀清除作用。由野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素對(duì)超氧自由基的清除效果可知，其各自A環(huán)上的鄰羥基與其清除作用密切相關(guān)，而野黃芩素的失效，很可能是因?yàn)橐包S芩苷受到超氧自由基的影響，A環(huán)7位脫去糖醛酸轉(zhuǎn)化為野黃芩素，因而掩飾了其真實(shí)效用。漢黃芩苷、白楊素-7-葡萄糖醛酸苷則是受到其B環(huán)上缺少羥基及其A環(huán)上缺失鄰羥基的原因，因而不具備超氧自由基的清除效果。

4 小結(jié)

黃芩中4種成分對(duì)3種自由基的作用可知，針對(duì)不同自由基，它們的作用效果并不相同。比較而言，黃芩素、野黃芩苷對(duì)超氧自由基的效果較好;黃芩苷對(duì)羥基自由基的效果較好;野黃芩素、黃芩素對(duì)過(guò)氧自由基的效果較好;比較野黃芩苷和野黃芩素對(duì)于過(guò)氧自由基清除作用，也驗(yàn)證野黃芩苷有效藥理作用代謝成分為野黃芩素的研究報(bào)道，同時(shí)本研究為黃芩抗自由基物質(zhì)的前期篩選開(kāi)發(fā)研究提供重要的理論依據(jù)。

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Screening Bioactive Constituents of Scavenging Free Radicals in Scutellaria baicalensis Georgi by Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Yuan-hong1，SONG Long2△
(1．Qizheng Tibetan Medicine Co．LTD．Gansu Lanzhou 730000，China;2．College of Pharmacy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)

Objectives:To rapidly screen bioactive constituents of scavenging body free radicals in Scutellaria baicalensis Georgi by using Liquid Chromatography-Mas Spectrometry(LC-MS).Methods:Mix scutellarin，baicalin，scutellarein，and baicalein sample solution with each free radical solution respectively and with methanol as control incubation cultivation，using LC-MS to detect the peak area change of each component.Results:After four components with the super oxygen free radical，hydroxyl free radical，oxygen free radical reacting，their content reduced in varying degree.Conclusions:Four components in Scutellaria baicalensis Georgi have certain scavenging effect against DPPH，superoxide free radicals，hydroxyl free radicals and peroxide free radicals.

Free radicals;Scutellaria baicalensis Georgi;LC-MS

R965.1

:B

:1006-3250(2015)09-1156-04

2015-03-02

劉淵宏，男，工程師，從事藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:宋 龍，男，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Tel:021-51322203，E-mail:sl1976@sina.cn。