納米銀支架治療重癥膽管炎的機(jī)制及抗菌性研究

呼增吉，賈長(zhǎng)庫(kù)，韓 霖，符 譽(yù)，黃小龍

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，海南 海口 570103）

·論 著·

納米銀支架治療重癥膽管炎的機(jī)制及抗菌性研究

呼增吉，賈長(zhǎng)庫(kù)，韓 霖，符 譽(yù)，黃小龍

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，海南 海口 570103）

目的 研究?jī)?nèi)鏡下納米銀支架治療急性重癥膽管炎(ACST)的機(jī)制及納米銀支架的抗菌性。方法將20頭豬隨機(jī)分為納米銀支架組(n=8)、普通支架組(n=8)和對(duì)照組(n=4)。對(duì)照組采用內(nèi)鏡下逆行膽管造影(ERC)，膽總管內(nèi)注入大腸桿菌，乳頭口用鈦夾夾閉，封閉乳頭。支架組在造模成功后行ERC+支架置入，支架末端在乳頭口處以鈦夾固定。觀察術(shù)后豬的一般情況，分別于術(shù)前、術(shù)后1 d、3 d、5 d采集豬血檢測(cè)其白細(xì)胞計(jì)數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血清膽紅素(TB)、血清腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)，觀察豬死亡后的膽管病理改變。結(jié)果三組豬術(shù)前的各項(xiàng)觀察指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；術(shù)后對(duì)照組的白細(xì)胞及分類、ALT、ALP、TB、TNF-α和IL-1水平均逐步上升，且在各時(shí)點(diǎn)均明顯高于兩支架組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；納米銀支架組和普通支架組在術(shù)后第五天白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、血清TNF-α和IL-1比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論細(xì)菌感染和膽道梗阻是ACST的主要病因，內(nèi)鏡下置入支架治療ACST，微創(chuàng)有效，納米銀支架有抗菌性。

重癥膽管炎；內(nèi)鏡；納米銀；支架；抗菌性

急性重癥膽管炎(Acute cholangitis of servere type，ACST)亦稱急性梗阻性化膿性膽管炎，是膽道感染和梗阻向嚴(yán)重階段發(fā)展的過(guò)程，是膽道疾病的嚴(yán)重感染并發(fā)癥。其起病急，發(fā)展快，常伴有感染性休克，病死率高。近年來(lái)，隨著對(duì)ACST的深入研究及內(nèi)鏡技術(shù)在膽道疾病中的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的ACST患者通過(guò)內(nèi)鏡治療得到救治。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在內(nèi)鏡下逆行膽管造影術(shù)(Endoscopic retrograde cholangiography，ERC)建立豬的ACST模型，將納米銀支架置入膽管治療ACST，研究納米銀支架治療ACST的優(yōu)越性及抗菌性。

1 材料與方法

1.1 納米銀支架制備方法 采用上海辛菖醫(yī)療器械公司生產(chǎn)的8.5F×6 cm聚丙烯塑料膽管支架為載體，以硝酸銀為原料，采用化學(xué)氧化還原法將納米銀顆粒還原并使之沉積在聚丙烯塑料膽管支架表面，使支架管的內(nèi)外表面均勻附著上納米銀顆粒。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 本地雜種豬20頭(海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)，體重(16±2)kg，雌雄各半，健康無(wú)疾病。隨機(jī)分為鈉米銀支架組(n=8)、普通支架組(n=8)和對(duì)照組(n=4)。

1.2.2 儀器與試劑 Pentax電子十二指腸鏡，愛(ài)爾博高頻電發(fā)生器，乳頭切開(kāi)刀，黃斑馬導(dǎo)絲，納米銀涂層支架，塑料支架(8.5F×6 cm上海辛菖醫(yī)療器械公司)，碘海醇造影劑，大腸桿菌菌株(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物室)。

1.2.3 內(nèi)鏡下膽管炎造模(對(duì)照組) 豬禁水禁食24 h，全身麻醉后在豬口腔內(nèi)置入一2 cm×12 cm自制的塑料套管，使門齒至咽部直線化(圖1)。采用左側(cè)臥位，電子十二指腸鏡經(jīng)塑料套管進(jìn)入咽部，經(jīng)食管、胃腔進(jìn)入幽門，在幽門下方1.5～2 cm處找到十二指腸乳頭，經(jīng)乳頭開(kāi)口插入乳頭切開(kāi)刀(圖2)，碘海醇造影劑進(jìn)行膽管造影，證實(shí)為膽管后抽出造影劑，經(jīng)乳頭切開(kāi)刀膽管內(nèi)注入大腸桿菌1 ml，注射完畢后經(jīng)乳頭切開(kāi)刀向膽管注入空氣0.5 ml，然后用鈦夾夾閉乳頭開(kāi)口。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

圖2 乳頭插管

1.2.4 膽管塑料支架置入(支架組) 造模后待豬出現(xiàn)高熱，脈率增快后，十二指腸鏡再次進(jìn)入豬十二指腸腸腔內(nèi)，異物鉗取出夾閉乳頭口的鈦夾，在預(yù)置支架的末端穿過(guò)一根4#絲線系成一線圈，沿導(dǎo)絲置入納米銀支架及塑料支架，用推送器將支架推送入膽管內(nèi)，末端側(cè)翼以下的支架留在十二指腸乳頭外，鈦夾通過(guò)線圈固定在乳頭口，以防支架脫出。透視下觀察支架的位置是否正常(圖3)。

圖3 X線下支架在位

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 一般情況 記錄各組豬的一般情況及病死率。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 各組豬分別于術(shù)前、術(shù)后1 d、3 d、5 d采集豬外周靜脈血，檢測(cè)其白細(xì)胞數(shù)及分類、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphate，ALP)、血清膽紅素(Total bilirubin， TB)、血清腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)。

1.3.3 病理檢查 豬若出現(xiàn)死亡立即行病理解剖，了解死亡原因。術(shù)后第5天處死所有豬，取膽管組織行病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 支架組豬麻醉蘇醒后即可進(jìn)食，但活動(dòng)量較術(shù)前有所減少，3 d后與術(shù)前比較無(wú)明顯變化。對(duì)照組豬蘇醒后進(jìn)食量明顯減少，出現(xiàn)精神萎靡不振，躁動(dòng)不安，高熱，呼吸急促，活動(dòng)差，尿色深，分別于術(shù)后26 h、40 h、48 h、70 h死亡。

2.2 白細(xì)胞數(shù)及其分類 術(shù)前三組豬的白細(xì)胞及分類比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后對(duì)照組豬的白細(xì)胞及分類在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于普通支架組及納米銀支架組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；普通支架組與納米銀支架組在術(shù)后第5天白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類組間比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 血清 TNF-α和 IL-1水平 術(shù)前三組TNF-α、IL-1的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，對(duì)照組術(shù)后TNF-α、IL-1在各時(shí)點(diǎn)明顯高于普通支架組和納米銀支架組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；普通支架組與納米銀支架組在術(shù)后第五天血清TNF-α、IL-1組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 血清ALT、ALP和TB水平 術(shù)前三組ALT、ALP和TB的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，術(shù)后對(duì)照組ALT、ALP和TB在各時(shí)點(diǎn)明顯高于普通支架組和納米銀支架組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；術(shù)后普通支架組、納米銀支架組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.5 病理改變 豬死亡后立即行病理解剖，腹腔內(nèi)有腹水形成，膽管內(nèi)見(jiàn)大量膿液(圖4)。普通支架組膽管壁血管擴(kuò)張充血，中性粒細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，病理切片中見(jiàn)到大量中性粒細(xì)胞聚集，有小膿腫形成；納米銀支架組散在杯狀細(xì)胞，血管輕度充血，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖4 術(shù)后解剖

表1 三組手術(shù)前后血液多項(xiàng)指標(biāo)的變化(±s)

表1 三組手術(shù)前后血液多項(xiàng)指標(biāo)的變化(±s)

組別對(duì)照組普通支架組納米支架組時(shí)間術(shù)前術(shù)后24 h術(shù)后72 h術(shù)后5 d術(shù)前術(shù)后24 h術(shù)后72 h術(shù)后5 d術(shù)前術(shù)后24 h術(shù)后72 h術(shù)后5 d白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L) 6.70±1.40 17.40±2.70 23.17±1.14 -5.90±0.85 15.30±1.80a13.60±4.30a11.17±4.10a7.20±0.62 11.35±2.50a9.23±1.50a7.33±2.14b中性粒細(xì)胞(%) 0.640±0.035 0.890±0.042 0.920±0.031 -0.683±0.045 0.861±0.020a0.802±0.035a0.750±0.031a0.653±0.043 0.935±0.026a0.650±0.012a0.42±0.015bTNF-α(pg/ml) 65.30±4.35 161.2±11.3a189.0±7.45a-55.30±6.30 133.1±15.4a103.2±13.4a93.40±6.10a62.40±7.60a96.10±4.65 89.60±6.41a66.10±4.65bIL-1(pg/) 75.60±15.20 192.1±20.45a256.4±29.70a-65.30±4.30 146.1±7.46a115.2±8.50a97.00±4.50a68.50±7.35a115.1±6.50a90.60±7.65a68.50±4.52bALT(U/L) 7.50±2.35 170.5±37.50 238.5±41.20 -7.30±1.50 56.0±10.60a33.10±5.60a26.10±4.80a7.40±1.24 45.10±8.90a27.10±4.90a30.10±3.50aALP(U/L) 44.20±12.23 178.0±38.50 376.5±61.80 -35.40±10.25 50.6±11.70a43.12±9.30a40.00±9.00a32.20±9.65 46.2±12.30a40.40±8.40a35.65±7.64aTB(μmmol/L) 8.50±2.54 156.50±37.4 232.00±41.20 -6.55±3.12 16.36±2.74a10.90±1.05a8.10±1.80a7.50±1.20 15.80±1.10a9.36±1.70a8.25±0.35a

注：TNF;血清腫瘤壞死因子，LL;白細(xì)胞介素，ALT;谷丙轉(zhuǎn)氨酶，TB；血清膽紅素。‘與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，‘與普通支架組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.05。

3 討 論

急性重癥膽管炎(ACST)是急性膽管炎的嚴(yán)重階段，起病急,病情發(fā)展快,常伴有膿毒癥及感染性休克,病死率高。ACST的發(fā)病機(jī)制是由于膽道梗阻后膽道系統(tǒng)壓力增高、經(jīng)膽汁進(jìn)入肝內(nèi)的細(xì)菌直接返流進(jìn)入血液，細(xì)菌大量繁殖引起膽管內(nèi)化膿性感染，繼而引起全身化膿性感染。因此膽道梗阻與細(xì)菌感染是重癥膽管炎的發(fā)病基礎(chǔ)。急性膽管炎時(shí)，如果膽道梗阻未解除，膽管內(nèi)細(xì)菌引起的感染沒(méi)有得到控制，逐漸發(fā)展至ACST并威脅患者的生命[1]。內(nèi)鏡下治療ACST具有快速、方便、診斷準(zhǔn)確、微創(chuàng)等優(yōu)越性，目前已成為治療ACST的主要手術(shù)方式[2-3]。

因?yàn)樨i來(lái)源廣，且與人類的解剖結(jié)構(gòu)相近，實(shí)驗(yàn)用它來(lái)制作ACST模型。和其他實(shí)驗(yàn)者采用開(kāi)腹手術(shù)建立模型不同，本實(shí)驗(yàn)采取內(nèi)鏡下通過(guò)十二指腸乳頭行膽管插管來(lái)建立ACST模型，根據(jù)膽道梗阻和細(xì)菌感染是重癥膽管炎發(fā)病的基礎(chǔ)，在膽管內(nèi)注射大腸桿菌,鈦夾夾閉乳頭口來(lái)制作ACST模型，該方法操作方便簡(jiǎn)單，模型可靠，微創(chuàng)，避免了開(kāi)放手術(shù)對(duì)動(dòng)物生理機(jī)能的干擾[4]。造模成功后，內(nèi)鏡下置入膽道支架，為防止支架脫落，支架末端縫扎一線圈，鈦夾夾閉腸壁固定。結(jié)果表明，對(duì)照組動(dòng)物蘇醒后進(jìn)食量明顯減少，出現(xiàn)精神萎靡，煩躁不安，體溫驟升，呼吸急促，活動(dòng)差，最終導(dǎo)致死亡。支架組除進(jìn)食及活動(dòng)稍有減少外，一般情況與術(shù)前無(wú)明顯變化；主要是支架組放置支架解除了梗阻，引流了感染灶，故癥狀較輕，術(shù)后恢復(fù)快。

在炎性反應(yīng)過(guò)程中TNF-α出現(xiàn)最早而且是最重要的炎性介質(zhì),能夠激活淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，調(diào)節(jié)其他組織的代謝活性，促使其他細(xì)胞因子(如IL-6、IL-8等)的釋放，是許多炎性反應(yīng)的中心介質(zhì)[5]。IL-1也是促炎細(xì)胞因子，是在全身炎癥反應(yīng)中起核心作用的細(xì)胞因子[6]。因此將炎癥因子TNF-α，IL-1作為主要觀察指標(biāo)。術(shù)后對(duì)照組血清TNF-α，IL-1指標(biāo)在各時(shí)點(diǎn)明顯高于支架組(P＜0.05)。對(duì)照組因?yàn)榇竽c桿菌持續(xù)釋放內(nèi)毒素,內(nèi)毒素是刺激細(xì)胞因子分泌最主要的物質(zhì)，在內(nèi)毒素等抗原的激活下，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生和釋放的多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)顯著升高。而支架組由于膽道支架的引流作用使炎癥的逐漸減輕。對(duì)照組血清ALT，ALP和TB水平顯著高于支架組(P＜0.05)，可能與膽道梗阻后，膽道壓力增高致細(xì)菌感染及內(nèi)毒素反流造成肝臟損傷有關(guān)。

銀是一種安全廣譜的抗菌材料。銀被納米化后兼具銀元素與納米材料的特性，具有更優(yōu)良的抗菌效果[7]。納米銀是指在1～100 nm之間的金屬銀微粒組成的粉體，是以納米技術(shù)為基礎(chǔ)研制而成的新型抗菌產(chǎn)品，由于其顆粒極其微小，表面積較大，使其具有顯著的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)，因而具有其他無(wú)機(jī)抗菌劑無(wú)可比擬的抗菌療效，而且安全性高、持久強(qiáng)[8]。

術(shù)后5 d電鏡下觀察無(wú)論是普通支架組還是納米銀支架組均可觀察到支架下段粘附細(xì)菌較中段、上段明顯密集，提示接觸十二指腸返流物機(jī)會(huì)多的部位細(xì)菌生物膜形成明顯。普通支架粘附的細(xì)菌密集、菌群種類和數(shù)量多，而納米銀支架表面粘附的細(xì)菌明顯較少，可見(jiàn)較多為結(jié)晶顆粒。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)[9-10]，對(duì)包括金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、腸球菌、淋球菌、念珠菌等在內(nèi)的十余種微生物的研究發(fā)現(xiàn)，納米銀對(duì)不同微生物的生物被膜的形成有不同的抑制作用。分析白細(xì)胞、TNF-α、IL-1發(fā)現(xiàn)，術(shù)后5 d納米銀支架組與術(shù)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而普通支架組較納米銀支架組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。通過(guò)膽管組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，雖然兩組都有膽管壁組織水腫、血管充血擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，但普通支架組炎癥更為嚴(yán)重，有的膽管壁內(nèi)可以看到膿腫形成。結(jié)合術(shù)后白細(xì)胞水平、TNF-α、IL-1變化，筆者認(rèn)為納米銀支架可以減少細(xì)菌生物膜的形成，抑制支架表面細(xì)菌的粘附，具有明顯抗菌的作用。

本研究結(jié)果表明，細(xì)菌感染和膽道梗阻是ACST的主要發(fā)病因素，內(nèi)鏡下膽管內(nèi)支架置入內(nèi)引流微創(chuàng)治療ACST療效確切，納米銀膽管支架具有明顯抗菌作用。

[1]陳孝平,汪建平.外科學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013.

[2]Agarwal N,Sharma BC,Garg S,et al.Endoscopic management of postoperative bile leakage[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2006, 5(2):273-277.

[3]Sung JY,Leung JW,Shaffer EA,et al.Ascending infection of the biliary tract after surgical sphincterotomy and biliary stenting[J].J Gastroenterol Hepatol,1992,7(3):240-245.

[4]呼增吉,賈長(zhǎng)庫(kù),范志寧,等.內(nèi)鏡下豬急性重癥膽管炎模型的建立[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2014,28(7):652-654.

[5]袁 濤,劉宏鳴,賴曉東,等.TNF-α在急性膽管炎大鼠血漿和膽汁中的變化[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38(20):2601-2602.

[6]Chiang SR,Tang HJ,Chang PC,et al.Synergistic antimicrobial effect of cefotaxime and minocycline on proinflammatorycytokine levels in a murine model of Vibrio vulnificus infection[J].Microbiol Immunol Infect,2007,40(2):123-133.

[7]Alt V,Bechert T,Steinrücke P,et al.Anin vitroassessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement[J].Biomaterials,2004,25(18):4383-4913.

[8]Jeon HJ,Yi SC,Oh SG.Preparation and antibacterial effects of Ag-SiO2thin films by sol-gel method[J].Biomaterials,2003,24 (27):4921-4928.

[9]Percival SL,Bowler PG,Dolman J.Antimicrobial activity of silver-containing dressings on wound microorganisms using an in vitro biofilm model[J].Int Wound J,2007,4(2):186-191.

[10]何 偉,王 翔,高 瑩,等.新型納米銀-聚氨酯膽道支架表面抗菌涂層的體外抑菌實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011, 15(3):453-456.

Mechanism of nano silver stents in the treatment of acute cholangitis of severe type and the antibacterial property of nano silver stents.

HU Zeng-ji,JIA Chang-ku,HAN Lin,FU Yu,HUANG Xiao-long.Department of Heptatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570103,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the mechanism of nano silver stents in the treatment of acute cholangitis of severe type(ACST)and the antibacterial property of nano silver stents under endoscope.MethodsTwenty pigs were randomly divided into nano silver stent group(n=8),ordinary stent group(n=8)and control group(n=4).The control group was treated by endoscopic retrograde biliary imaging(ERC),followed by injectingE.colithrough bile duct and enclosing papilla with titanium clips.The nano silver stent group and ordinary stent group were treated by ERC combined with stent implantation,followed by enclosing papilla with titanium clips.The peripheral blood samples were collected pre-operatively and at 1 day,3 day,5 day post-operatively for detection of white blood cell(WBC),alanine aminotransferase(ALT),alkaline phosphate(ALP),total bilirubin(TB),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-1(IL-1).The pathological changes of bile duct were observed when the pigs were executed.ResultsThere were no significant differences between three groups pre-operatively.The changes of peripheral WBC,ALT,ALP,TB,TNF-αand IL-1 levels post-operatively in control group increased gradually,which were significantly higher than nano silver stent group and ordinary stent group(P＜0.05).The changes of peripheral WBC,TNF-αand IL-1 levels in ordinary stent group and nano silver stent group showed statistically significant difference at 5 day post-operatively(P＜0.05).ConclusionInfection and biliary obstruction are the main cause of ACST.Endoscopic stent implantation is minimally invasive for treatingACST,and nano silver stent has antimicrobial properties.

Acute cholangitis of severe type;Endoscope;Nano silver;Stent;Antibacterial property

R657.4+5

A

1003—6350（2015）23—3433—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1247

2015-06-30)

2013年海南省衛(wèi)生廳課題(編號(hào)：瓊衛(wèi)2013—資助032號(hào))

呼增吉。E-mail：huzengji@126.com