VASH1在口腔鱗狀細胞癌、口腔白斑及口腔扁平苔蘚中的表達及意義

孫 鑫，魏秀峰，呂珊珊，劉 桐，安歡歡，李 娜，谷 楠

(吉林大學口腔醫院口腔黏膜病科，吉林 長春 130021）

·臨床病理·

VASH1在口腔鱗狀細胞癌、口腔白斑及口腔扁平苔蘚中的表達及意義

孫 鑫，魏秀峰，呂珊珊，劉 桐，安歡歡，李 娜，谷 楠

(吉林大學口腔醫院口腔黏膜病科，吉林 長春 130021）

目的 探討血管生成抑制蛋白1(VASH1)在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)、口腔白斑(OLK)和口腔扁平苔蘚(OLP)中的表達及意義。方法免疫組織化學染色SP法檢測60例OSCC、20例OLK、20例OLP及20例正常口腔黏膜(NOM)中VASH1的表達情況，采用SPSS19.0軟件對結果進行統計學分析。結果(1)VASH1蛋白在OSCC組織中的陽性表達率和染色強度隨組織分化程度的降低而呈增高趨勢(P＜0.05)，并且在中、低分化的鱗狀細胞癌中的表達明顯高于白斑，差異有統計學意義(P＜0.05)；(2)VASH1在白斑中的表達明顯高于正常組織和扁平苔蘚，且差異有統計學意義(P＜0.05)；(3)VASH1在扁平苔蘚與正常組織的表達情況差異無統計學意義(P＞0.05)；(4)口腔鱗癌組中VASH1在有淋巴轉移組的表達明顯高于無淋巴轉移組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論VASH1蛋白可能與口腔鱗狀細胞癌的發生、發展及轉移有關。

血管生成抑制蛋白1；口腔鱗狀細胞癌；口腔白斑

口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是發生在口腔黏膜中最常見的惡性腫瘤。口腔鱗癌常向區域淋巴結轉移，晚期可發生遠處轉移，其分化程度越低，惡性程度越高。口腔白斑(Oral leukoplakia，OLK)是最常見的口腔癌前病變，有3%～5%的口腔白斑會轉變為口腔鱗狀細胞癌。口腔扁平苔蘚(Oral lichen planus，OLP)是較常見的口腔黏膜斑紋類疾病，目前多認為口腔扁平苔蘚是一種癌前狀態[1]。血管生成抑制因子(Vasohibin-1，VASH1)作為新近發現的蛋白因子，其具有負反饋調節血管生成的作用，是由血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維生長因子2 (Fibroblast growth factor-2，FGF2)等誘導產生，在乳腺癌[2]、食管鱗狀細胞癌[3]、尿路上皮癌等腫瘤[4]中不僅可以抑制腫瘤的血管生成，而且對于腫瘤淋巴管生成和淋巴結轉移也有強大的抑制作用[5]，目前關于VASH1在口腔中的表達情況尚未見報道。本研究采用免疫組化SP法檢測OSCC、OLK、OLP和NOM中VASH1蛋白的表達，并探討其表達與臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取吉林大學口腔醫院病理教研室保存的60例口腔鱗狀細胞癌(高分化、中分化和低分化鱗癌各20例)石蠟標本，20例口腔白斑和20例口腔扁平苔蘚石蠟標本；選取20例正常口腔黏膜(Normal oral mucosa，NOM)作為對照。60例OSCC患者中男性40例，女性20例；年齡34～74歲，平均56.18歲；按照國際抗癌聯盟UICC2002年修訂的TNM分期標準，其中Ⅰ期21例，Ⅱ期16例，Ⅲ期22例，Ⅳ期1例；有淋巴結轉移24例，無淋巴結轉移36例。

1.2 實驗試劑 兔抗人VASH1抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司，陽離子防脫玻片購于北京中杉金橋生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)。

1.3 免疫組化染色 標本常規石蠟包埋，切片厚2 μm，具體染色步驟如下：蠟切片脫蠟和水化后，置煮沸的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中抗原修復15 min后，冷卻至室溫，PBS沖洗，內源性過氧化酶阻斷劑(試劑A)室溫孵育10 min，PBS沖洗，非免疫羊血清(試劑B)室溫孵育10 min，試凈勿洗，加入一抗VASH1(兔抗人，稀釋比例為1:400)4℃冰箱孵育過夜，復溫，PBS沖洗，滴加生物素標記的羊抗鼠/兔IgG (試劑C)室溫孵育10 min，PBS沖洗，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(試劑D)室溫孵育10 min，PBS沖洗。用新鮮配制的DAB染色，而后自來水充分沖洗，蘇木素復染，分化，返藍，脫水透明，封片。以PBS代替第一抗體為陰性對照。

1.4 結果判定 根據相關文獻[1，3]判定標準，VASH1的陽性表達以細胞質和(或)細胞膜呈淡黃色至棕褐色顆粒狀著色為陽性細胞。每張切片選取8個200倍視野觀察，采用雙盲法判定結果，同時由兩位資深病理科醫師獨立評分。染色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比：0為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。以兩項得分的乘積作為總分，總分≥4分為陽性。總分為4～6分為弱陽性，記為(+)；6～8分為中度陽性，記為(++)；＞8分為強陽性，記為(+++)。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，樣本率的比較采用χ2檢驗，以α=0.05作為顯著性檢驗的標準，以雙側P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 VASH1在口腔鱗癌、口腔白斑、口腔扁平苔癬及正常口腔黏膜中的表達情況 VASH1在正常口腔黏膜和口腔扁平苔蘚中多為陰性或弱陽性表達，在口腔扁平苔蘚中70.00%為陰性表達，25.00%為弱陽性表達，僅有5.00%為中度陽性表達；在正常口腔黏膜中85.00%為陰性表達，15.00%為弱陽性表達；在口腔白斑中30.00%為陰性表達，30.00%為弱陽性表達，30.00%為中度陽性表達，10.00%為強陽性表達；在口腔鱗癌中20.00%為陰性表達，18.33%為弱陽性表達，30.00%為中度陽性表達，31.67%為強陽性表達，見圖1～圖6及表1。

圖1 正常口腔黏膜（×200）

圖2 扁平苔蘚（×200）

圖3 口腔白斑(×200)

圖4 高分化鱗狀細胞癌(×200)

圖5 中分化鱗狀細胞癌(×200)

圖6 低分化鱗狀細胞癌(×200)

表1 VASH1在OSCC、OLK、OLP及NOM中的表達情況(例)

2.2 VASH1在口腔鱗癌中的表達情況與臨床病理特點的相關性 VASH1在口腔鱗癌中的表達明顯高于口腔扁平苔蘚和正常口腔組織，且差異有統計學意義(P＜0.05)；VASH1在口腔白斑中的表達也明顯高于口腔扁平苔蘚和正常口腔黏膜組織，差異有統計學意義(P＜0.05)；VASH1在口腔鱗癌中的表達隨著分化程度的降低而逐漸增強，且VASH1表達與腫瘤分化程度、TNM分期及有無淋巴轉移差異有統計學意義(P＜0.05)，但與患者的性別、年齡無關(P＞0.05)，見表2。

表2 OSCC組織中VASH1蛋白表達與各臨床參數的關系[例(%)]

3 討 論

VASH是由VEGF和FGF2誘導的具有抑制血管生成的基因，由研究者通過DNA微陣列分析在血管內皮細胞中發現的[6]。VASH有兩個同系物，即VASH1及VASH2[7]，VASH1被認為是一種來源于內皮細胞的負性調節血管新生的蛋白[8]，而VASH2則是一種不依賴于VEGF的且非內皮細胞所固有的促血管生成因子[9]。VASH1具有抑制血管生成的作用，并表達于血管內皮細胞、心肌及橫紋肌[10]等，在血管發芽之前終止血管生成，還能夠抑制腫瘤的發展和淋巴結轉移[11]。

近年的研究發現VASH1在多種惡性腫瘤中存在高表達。本研究對NOM、OLP、OLK和OSCC中VASH1的表達進行了檢測，結果顯示：VASH1在NOM中低表達，與Yoshinaga等[12-13]的結論相近；在OSCC發展的過程中，VASH1的表達強度隨病理分級的升高而增強，這與郭曉峰等[3]對VASH1在食管鱗狀細胞癌中的研究結論相同；VASH1在OSCC中的表達明顯高于NOM，差異有統計學意義，提示OSCC的發病可能與VASH1的表達存在著內在聯系；VASH1在OLK中的表達也明顯高于OLP和NOM，差異有統計學意義，表明相比于OLP和NOM，OLK與VASH1表達的相關性更為密切；VASH1在OSCC中的表達隨著分化程度的降低而逐漸增強，表明VASH1與OSCC的分化程度密切相關；OSCC中VASH1表達與TNM分期及有無淋巴轉移差異有統計學意義，表明VASH1的表達與OSCC的TNM分期及有無淋巴結轉移相關。我們推測OSCC中VASH1的表達增高可能是由于機體負反饋調節，拮抗血管生長促進因子，而出現高表達。

綜上所述，VASH1在OSCC中的表達隨著分化程度的降低而逐漸升高，即分化程度越差，VASH1的表達越高；VASH1在OSCC中也有較高的表達，可能與其易癌變有一定的關系，但其具體機制尚不明確，仍有待探討；VASH1表達與OSCC的分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移相關，可能與OSCC的發生、發展及轉移有關。VASH1具有抑制腫瘤血管和淋巴管生成的作用，有望成為抗OSCC血管形成及腫瘤治療的新方法，但其與口腔黏膜癌前病變癌變機制、口腔鱗癌的發病機制以及臨床應用仍需進一步探索。

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Expression and significance of VASH1 protein in oral squamous cell carcinoma,oral leukoplakia and oral lichen planus.

SUN Xin,WEI Xiu-feng,LV Shan-shan,LIU Tong,AN Huan-huan,LI Na,GU Nan.Department of Oral Mucosal Disease Office,Hospital of Stomatology,Jilin University,Changchun 130021,Jilin,CHINA

ObjectiveTo explore the expression of vasohibin1(VASH1)in oral squamous cell carcinoma (OSCC),oral leukoplakia(OLK),oral lichen planus(OLP).MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of VASH1 in 60 cases of OSCC,20 cases of OLK,20 cases of OLP and 20 cases of normal oral tissue. SPSS19.0 was used for statistical analysis.Results(1)The positive expression and staining intensity of VASH1 protein in the OSCC tissue showed an increasing trend with the decreasing of the tissue differentiation degree(P＜0.05). The expression of VASH1 in moderately and poorly differentiated OSCC was significantly higher than that in OLK (P＜0.05).(2)The expression of VASH1 in OLK was significantly higher in that in normal oral mucosa(NOM)and OLP(P＜0.05).(3)The expression of VASH1 in OLP and NOM showed no statistically significant difference(P＞0.05).(4)The expression of VASH1 in oral squamous cell carcinoma with lymph node metastsis group was significantly higher than that without lymph node metastasis group(P＜0.05).ConclusionVASH1 protein may be related to the occurrence of OSCC,development and metastasis.

Vasohibin1(VASH1);Oral squamous cell carcinoma(OSCC);Oral leukoplakia(OLK)

R739.85

A

1003—6350（2015）23—3560—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1288

2015-05-12)

魏秀峰。E-mail：xfw79@sina.com