周脂素和ADRP在糖代謝異常大鼠肝臟組織中的表達*

樊林花， 劉茂林， 衛兵艷， 劉田福， 王春芳 龐文彪， 郭永昌， 劉建新

(1山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物和人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001； 2山西省一○九醫院，山西 太原 030006)

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·短篇論著·

周脂素和ADRP在糖代謝異常大鼠肝臟組織中的表達*

樊林花1， 劉茂林1， 衛兵艷1， 劉田福1， 王春芳1龐文彪1， 郭永昌1， 劉建新2△

(1山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物和人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001；2山西省一○九醫院，山西 太原 030006)

目的： 探討脂滴相關蛋白周脂素(perilipin)和脂肪分化相關蛋白(ADRP)在糖尿病發生發展過程中的變化情況以及在糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝中的作用。方法: 分別用高脂飼料喂養和高脂飼料喂養加小劑量鏈脲佐菌素建立糖耐量受損(IGT)和2型糖尿病大鼠模型(T2DM)，采用光鏡觀察各組大鼠肝組織的形態學改變；用ELISA法測定血清周脂素perilipin和ADRP含量；real-time PCR 技術檢測肝臟組織中perilipin和ADRP mRNA的表達；用 Western blotting法檢測肝臟組織中ADRP蛋白的表達。結果: HE結果顯示， IGT組和 T2DM組大鼠均有肝細胞脂肪變性，IGT組變性更嚴重；各模型組的生化指標與臨床相關疾病的表現一致；血清perilipin水平各組之間無差異，但IGT組和T2DM組肝組織perilipin mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組perilipin mRNA表達顯著增加(P<0.05)。T2DM組血清ADRP含量較其對照組明顯降低(P<0.01)；模型組肝組織ADRP mRNA表達明顯降低(P<0.01)；ADRP蛋白表達較其對照組也明顯降低(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組ADRP mRNA表達明顯降低(P<0.01)。結論: 血清ADRP含量在T2DM的形成中起一定的作用，與胰島素抵抗指數呈明顯負相關；高脂喂養后能導致大鼠糖代謝異常，并伴有非酒精性脂肪肝的發生；糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發生可能與肝組織perilipin表達升高和ADRP表達降低有關。

周脂素； 脂肪分化相關蛋白； 糖耐量受損； 2型糖尿病

2型糖尿病發病機制復雜，但胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和脂代謝紊亂是其主要特征，研究表明，脂肪分解途徑紊亂可能是聯系IR和糖代謝異常時高脂血癥的重要環節[1]。近年來研究發現脂滴相關蛋白perilipin和ADRP等對脂肪的代謝調節具有重要作用[2-3]。盡管脂代謝紊亂在糖尿病中發揮著重要作用，但就perilipin和ADRP而言在糖代謝異常的不同病理狀態下研究較少，且尚未見在糖耐量受損階段的相關報道，因此，本實驗室建立糖耐量受損(impaired glucose tolerance，IGT)大鼠模型和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠模型，觀察不同糖代謝狀態下血清及肝組織周脂素(perilipin)和ADRP的表達狀況，旨在探討perilipin和ADRP在糖尿病發生發展過程中的變化，以及在糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要儀器與試劑

酶標儀(BioTeK)；全自動生化測定儀(Beckman Coulter Lx-20)，所用試劑、質控及標準均為Beckman 生產；高速冷凍離心機(Sigma)；德國羅氏優越H型血糖儀及試紙，熒光定量PCR儀(ABI 7300)；垂直電泳儀(Bio-Rad)；鏈脲佐菌素(Sigma)；GPO-PAP試劑盒(南京建成生物研究所)；Perilipin、ADRP與胰島素ELISA試劑盒(R&D)；ADRP和GAPDH抗體(Abclonal Biotechnology)；RNAiso Plus總RNA提取試劑、RT試劑盒、PCR試劑盒以及perilipin、ADRP和β-actin引物由寶生物工程大連有限公司提供或合成。

2 動物模型的建立及樣本收集

健康SD大鼠60只，雄性，清潔級，體質量170～210 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供[合格證編號為SCXY(晉)2009-0001]，飼養于本中心屏障環境動物實驗室[合格證編號為SYXY(晉)2009-0004]，將大鼠隨機分為IGT模型組(IGT)、IGT對照組(control)、2型糖尿病組(T2DM)和糖尿病對照組(T2DM control)，對照組飼喂普通飼料 (3.2 kCal/g，其中脂肪、碳水化合物和蛋白質分別提供熱量10.2%、66.5%和23.3%)，模型組飼喂高脂飼料(5.24 kCal/g，其中脂肪、碳水化合物和蛋白質分別提供熱量 60%、20%和 20%)，自由飲水，IGT組及其對照組共飼養12周。2型糖尿病組飼喂高脂飼料4周后，腹腔注射小劑量STZ(35 mg/kg)[4]，其對照組腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。每4周測量1次體重。

IGT組高脂飼養12周后，進行口服糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)，選出OGTT中2 h血糖值在7.8～11.1 nmol/L且伴有胰島素抵抗[用胰島素抵抗指數(HOMA-IR)來評判]者為IGT大鼠[5]。糖尿病組于注射鏈脲佐菌素72 h后，檢測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，選擇FBG高于11.1 nmol/L為2型糖尿病大鼠模型[6]。選擇擬處死大鼠禁食12 h以上，稱重，腹主動脈采血，分離血清，在-80 ℃保存，備測生化指標、脂滴相關蛋白和胰島素水平。迅速摘取肝臟，切取同一部位肝組織以備病理檢測；另取一部分用鋁箔包好液氮速凍后，凍存于-80 ℃冰箱，以備real-time PCR和Western blotting以及肝組織甘油三酯檢測。每組選取6份樣本進行real-time PCR和Western blotting檢測。

3 主要方法

3.1 血清perilipin、ADRP和空腹胰島素(fasting insulin, FINS)含量的檢測 ELISA法測定血清perili-pin、ADRP和FINS含量，按照試劑盒說明書進行操作。

3.2 血生化指標檢測 FBG及2 h OGTT血糖用快速血糖儀測量；甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)用全自動生化測定儀測定，按照操作規程和試劑使用說明進行；HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

3.3 大鼠肝組織脂質含量測定 取300 mg肝臟組織，經氯仿/甲醇抽提TG后，分離水相物質和有機相物質，吸取有機相物質，應用GPO-PAP試劑盒測肝組織TG含量。

3.4 肝臟組織病理學檢查 肝臟組織經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋， 4 μm厚度切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織形態學改變。

3.5 實時熒光定量PCR 技術檢測肝臟perilipin和ADRP mRNA的表達 剪取凍存的肝組織 50 mg， 按試劑說明書操作， 提取總 RNA， 逆轉錄成 cDNA， 然后進行熒光定量PCR 擴增， 以β-actin作為內參照，用2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達量。Perilipin的上游引物為5’-CGAGTCACAACCCCACGAT-3’，下游引物為5’-TCAGCCCACGAGAGAGGAA-3’；ADRP的上游引物為5’-CGTGGAAAGGACCAAGTCTG-3’，下游引物為5’-TTCTGAGTGAGCGGCAAGTA-3’；β-actin的上游引物為5’-CCACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下游引物為5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’。 擴增條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循環40次。

3.6 Western blotting法檢測肝臟組織中ADRP蛋白的表達 提取肝組織總蛋白，用BCA法定量，將定量好的組織蛋白變性后，進行聚丙烯凝膠電泳，將分離后的蛋白轉到NC膜，麗春紅染色后用蒸餾水脫色至褪去。將裁好的膜置于蛋白干粉的封閉液中(室溫輕搖1 h)。將封閉好的膜置于 I 抗稀釋液中(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入HRP標記的 II 抗中室溫孵育1 h，洗滌后，DAB顯色，Bandscan軟件對顯影條帶進行灰度分析，將ADRP灰度值與內參照GAPDH灰度值的比值作為其蛋白的相對表達水平。

4 統計學處理

數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，以單因素方差分析比較各組的均數差異；相關性采用Pearson相關檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大鼠體質量的變化及成模情況

各組大鼠實驗起始(0 d)體質量無差異，從30 d開始，至實驗結束，各模型組體質量明顯高于其對照組(P<0.01)。隨時間延長，兩者體質量的差距雖然呈進行性增加,但其差距的增長幅度有所降低。IGT組20只大鼠，成模12只，成模率為60%，T2DM組20只死亡6只，其余的全部成模，見表1。

表1 各組不同時點體質量變化

**P<0.01vsIGT control;##P<0.05vsT2DM control.

2 各組大鼠生化指標檢測結果

與各自對照組相比，IGT組和T2DM組血清FINS、TG、TC、HOMA-IR、ALT和肝組織TG水平明顯升高(P<0.05)；IGT組與其對照組相比，血清FBG、AST、ADRP和perilipin含量無顯著差異(P>0.05)；T2DM組與其對照組相比，血清FBG、AST和perilipin含量無顯著差異(P>0.05)，ADRP含量明顯降低(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組FBG、HOMA-IR和TC明顯升高(P<0.01)，FINS和肝組織的TG明顯降低(P<0.01)；IGT對照組與T2DM對照組相比，除ADRP含量顯著降低外(P<0.01)，其余各指標均無顯著差異，見表2。

表2 各組大鼠生化指標檢測結果

*P<0.05,**P<0.01vsIGT control;##P<0.01vsT2DM control;△△P<0.05vsIGT.

3 各組肝組織病理學變化

IGT對照組的肝組織基本正常，肝細胞結構基本完整清晰，偶見胞漿內有小脂滴；T2DM對照組肝組織正常，肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，形態規則；IGT組的肝細胞腫脹，胞漿內有大小不等的脂滴，部分脂滴形成大空泡，將細胞核擠向一側，肝小葉結構破壞，肝細胞內有大量脂滴存在，肝脂肪變性明顯并伴有炎癥細胞浸潤，可見點狀或小灶性壞死；T2DM組的肝小葉結構紊亂，大部分肝細胞體積增大，大小不均，多數細胞內可見大小不等的脂滴，小葉內炎癥細胞浸潤，伴有散在的點狀壞死，肝組織脂肪變性沒有IGT組嚴重，見圖1。

Figure 1.Morphological changes of the liver tissues in different groups (HE staining, ×200).

4 不同糖代謝大鼠肝臟組織perilipin和ADRP mRNA表達的變化

與各自對照組相比，IGT組和T2DM組的肝組織perilipin mRNA表達明顯升高，分別是各自對照組的(1.87±0.28)倍和(2.17±0.13)倍(P<0.01)；ADRP mRNA表達明顯降低，分別是各自對照組的(77±14)%和(47±5)%(P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組perilipin mRNA表達升高(P<0.05)，ADRP mRNA表達明顯降低(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of perilipin and ADRP in the liver tissues. Mean±SD. n=6. *P<0.01 vs IGT control; #P<0.05 vs T2DM control; △P<0.05, △△P<0.01 vs IGT.

5 不同糖代謝大鼠肝臟組織ADRP的蛋白表達水平

與各自對照組相比，IGT組和T2DM組的肝組織ADRP蛋白表達明顯降低(均P<0.01)；與IGT組相比，T2DM組的ADRP蛋白表達水平有所降低，但無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 3.The protein expression of ADRP in liver tissues. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs IGT control; ##P<0.01 vs T2DM control.

6 Perilipin和ADRP與各指標的相關性分析

相關分析結果顯示，血清perilipin水平與各指標沒有相關性，但肝組織perilipin mRNA表達與FBG、HOMA-IR、TG、TC、ALT及肝組織TG呈明顯正相關(P<0.05)，與血清ADRP含量和肝組織ADRP mRNA及蛋白表達呈明顯負相關(P<0.01)；血清ADRP含量與肝組織mRNA及蛋白表達呈明顯正相關(P<0.01)，與HOMA-IR、TG、ALT及肝組織TG呈明顯負相關(P<0.05)；肝組織ADRP mRNA及蛋白表達均與HOMA-IR、FINS、FBG、TG、TC、ALT和肝組織TG呈明顯負相關(P<0.05)。

討 論

本實驗采用單純高脂飼料喂養SD大鼠復制IGT模型，該模型組大鼠體重明顯增加，12周時空腹血糖與對照組血糖相比無顯著差異，但OGTT 2 h明顯升高，達到了糖耐量受損的診斷標準，成模率為60%，且判斷胰島素抵抗的指標——HOMA-IR與對照組相比有顯著差異，說明已形成胰島素抵抗，肥胖IGT大鼠模型復制成功；以高脂飼料加小劑量STZ復制T2DM模型， 該組體重增加明顯，空腹血糖比對照組明顯升高，除個別死亡外，全部達到了T2DM的診斷標準，HOMA-IR也明顯增大，說明T2DM模型制備成功。所制備的模型均具有高胰島素血癥、高脂血癥、胰島素抵抗和肝臟脂質沉積等特點，這些與臨床相應的IGT和T2DM在生化指標方面相符，符合糖尿病發生發展的慢性病理過程。

IGT是一種糖代謝介于正常和糖尿病之間的血糖異常代謝狀態，此階段屬于糖尿病前期，在此期間出現的癥狀未達到糖尿病標準，不易引起足夠重視，但體內糖代謝平衡已破壞，成為T2DM及其并發癥風險的一個重要誘因，因此IGT階段的監測和干預具有重要意義。非酒精性脂肪肝就是糖耐量受損階段以及2型糖尿病期間發生的并發癥之一[7]。本實驗肝臟HE染色顯示，IGT組由于高脂飼料喂養相對較長，肝組織脂肪變性嚴重；T2DM組脂肪變性較IGT組有所減輕，IGT對照組雖未用高脂飼料喂養，但實驗周期相對較長，體重增加也明顯，肝組織內偶見脂肪變性細胞，T2DM對照組肝組織未見有脂肪變性細胞，這與生化檢測指標相一致，能夠代表不同糖代謝異常下肝組織的病理狀態用于后續研究。

脂肪細胞最主要成分是細胞內脂滴，其表面覆蓋如perilipin和ADRP等多種脂滴相關蛋白，這些蛋白對脂滴的代謝和調節具有重要作用[8]，目前對于perilipin和ADRP的研究尚處于起步階段，主要集中在脂解及肥胖等方面，而且在肥胖研究中存在爭議[9-10]，在糖異常狀態下表達情況報道較少。因此本實驗檢測了糖代謝異常大鼠血清及肝臟組織中perilipin和ADRP的表達水平，探討perilipin和ADRP在糖尿病發生發展過程中以及在糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝中是否起一定的作用。實驗結果顯示，各組大鼠血清中perilipin含量無差異，但模型組肝組織中perilipin mRNA表達均明顯升高，與Kenr等[10]在脂肪組織中的研究結果相一致。相關分析也表明肝組織perilipin mRNA表達與FBG、HOMA-IR、血清TG、肝組織TG呈明顯正相關，說明perilipin的明顯升高參與了糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發生。 T2DM模型組較其對照組血清ADRP明顯降低，在IGT模型組及對照組之間無顯著差異，相關分析表明，血清ADRP含量與HOMA-IR、血清TG、血清ALT、肝組織TG呈明顯負相關，說明血清ADRP在T2DM的形成中起一定的作用，而且IGT對照組其含量較T2DM對照組也明顯降低，這似乎暗示，在糖代謝正常的情況下，體重對血清ADRP含量有很大的影響。但肝組織ADRP mRNA和蛋白表達水平均表明，模型組較各自的對照組均明顯降低，與文獻報道不一致[11]，這可能與體內外實驗的不同有關，有待進一步加以驗證。相關分析表明，肝組織ADRP mRNA表達及蛋白表達均與HOMA-IR、FINS、FBG、TG、TC、ALT和肝組織TG呈明顯負相關。說明ADRP明顯降低參與了糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發生。

綜上所述，分別采用單純高脂飼料喂養和高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素可以復制IGT模型和T2DM模型，能夠代表不同糖代謝異常病理狀態用于后續研究。血清perilipin水平各組間表達無顯著差異，與胰島素抵抗指數也無相關性；但血清ADRP含量較T2DM對照組明顯降低，而且IGT對照組也明顯降低，這說明除糖脂代謝異常影響血清ADRP的水平外，似乎體重對其影響也很明顯。模型組肝組織perilipin mRNA表達均明顯升高，ADRP mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，說明糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發生可能與其perilipin表達的上調和ADRP表達的降低有關，其具體機制需進一步實驗研究加以探討。

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Expression of perilipin and ADRP in rat liver tissues with abnormal glucose metabolism

FAN Lin-hua1, LIU Mao-lin1, WEI Bing-yan1, LIU Tian-fu1, WANG Chun-fang1, PANG Wen-biao1, GUO Yong-chang1, LIU Jian-xin2

(1LaboratoryAnimalCenterofShanxiMedicalUniversity,ShanxiKeyLaboratoryofExperimentalAnimalsandAnimalMo-delsforHumanDiseases,Taiyuan030001,China;2109HospitalofShanxiProvince,Taiyuan030006,China.E-mail:jianxinliu_690101@sina.com)

AIM: To observe the changes of perilipin and adipose differentiation-related protein (ADRP) du-ring the development of diabetes mellitus and to explore the effect of perilipin and ADRP on abnormal glucose metabolism with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). METHODS: The rat model of impaired glucose tolerance (IGT) was induced by feeding high-fat diet, and the type 2 diabetes mellitus (T2DM) model was induced by feeding high-fat diet for 4 weeks and intraperitoneally injecting streptozotocin. The morphological change of the liver tissue was observed under optical microscope. The serum contents of perilipin and ADRP were measured by ELISA. The mRNA expression of perilipin and ADRP in the liver tissues was detected by real-time PCR. The protein expression of ADRP in the liver tissues was determined by Western blotting. RESULTS: HE staining showed steatosis in the liver of the rats in IGT group was more serious than that in T2DM group. The biochemical and the pathological processes of rat models were consistent with the clinical feature of related diseases. The serum content of perilipin had no difference among various groups. The mRNA expression of perilipin in IGT group and T2DM group was significantly higher than that in control group. Compared with IGT group, the mRNA expression of perilipin in T2DM group was significantly increased. The serum content of ADRP in T2DM group was significantly lower than that in control group. The mRNA and protein expression of ADRP in model groups was significantly lower than that in control group. Compared with IGT group, the mRNA expression of ADRP in T2DM group was significantly reduced. CONCLUSION: The serum content of ADRP plays a role in the development and progression of T2DM. It is negatively correlated with HOMA-IR. NAFLD occurs during progression of abnormal glucose metabolism induced by feeding high-fat diet. The development of abnormal glucose metabolism with NAFLD is probably related to the increased expression of perilipin and the reduced expression of ADRP.

Perilipin; Adipose differentiation-related protein; Impaired glucose tolerance; Type 2 diabetes mellitus

1000- 4718(2015)03- 0534- 05

2014- 08- 18

2014- 12- 24

山西省實驗動物專項資金資助項目(No. 2013k11); 山西醫科大學科技創新基金資助項目(No.01201425)

△通訊作者 Tel: 0351-2676672； E-mail: jianxinliu_690101@sina.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.026