全瑞蘭,玉永雄
(1.西南大學動物科技學院,重慶 400716;2.信陽市農業科學院,河南 信陽 464000)
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淹水對紫花苜蓿南北方品種抗氧化酶和無氧呼吸酶的影響
全瑞蘭1,2,玉永雄1*
(1.西南大學動物科技學院,重慶 400716;2.信陽市農業科學院,河南 信陽 464000)
以紫花苜蓿南方育成品種渝苜1號和北方地方品種新疆紫泥泉為材料,在幼苗長出4片真葉時進行淹水處理,在淹水的第10天測定植株的生物量,并分別在淹水的第0,2,4,6,8,10天測定葉片中的丙二醛(MDA)含量以及葉片抗氧化酶和根系無氧呼吸酶的活性,以探明兩個品種對淹水脅迫的耐受性差異及其生理響應機制。結果表明,淹水脅迫使紫花苜蓿的生物量減少,但與新疆紫泥泉相比,渝苜1號生物量的降幅小。淹水時渝苜1號葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性比新疆紫泥泉的高,而葉片MDA含量比新疆紫泥泉的低;根系無氧呼吸酶活性在淹水脅迫中均增強,但渝苜1號的乙醇脫氫酶(ADH)和丙酮酸脫羧酶(PDC)活性增加明顯,乙醇發酵更強;而新疆紫泥泉的乳酸脫氫酶(LDH)的活性增加更為突出,乳酸發酵強。淹水影響紫花苜蓿正常生長,但南方品種渝苜1號比北方品種新疆紫泥泉對淹水脅迫更具耐受性,因為前者具有比較高的抗氧化酶活性和比較強的乙醇發酵途徑,有利于增強植株抗淹水脅迫能力。
淹水脅迫;紫花苜蓿;品種;抗氧化酶;無氧呼吸酶
紫花苜蓿生態適應性廣,營養十分豐富,素有“牧草之王”的美譽,從西域傳入我國至今已有2000多年的栽培歷史,現在主要分布在華北、西北地區[1-2]。近年來,我國南方畜牧業快速發展,對優質豆科牧草的需求也越來越大[3]。而南方地區的多雨氣候條件造成土壤容易漬水,影響到紫花苜蓿的正常生長和發育[4]。渝苜1號紫花苜蓿是我國南方地區第一個紫花苜蓿育成品種,該品種在弱酸性、中性或堿性砂壤土上生長良好,在耐濕、耐熱、直立性、再生力、持久性等方面表現良好,雜草危害也相對較小。隨著紫花苜蓿南方品種渝苜1號的育成與推廣,將有利于解決南方地區優質豆科牧草不足的問題。淹水使植株根系周圍形成嫌氣環境,嚴重限制了植物的生長和產量[5-7]。濕澇脅迫引起細胞產生自由基,破壞細胞膜系統,造成離子滲漏和細胞死亡,高水平的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性對長時間淹水時多種植物的存活具有重要作用[8-9]。淹水條件下,植物根系缺氧,無氧呼吸增強,乙醇脫氫酶(ADH)、丙酮酸脫羧酶(PDC)和乳酸脫氫酶(LDH)活性增加,增強植株根系對缺氧環境的適應性[10-12]。目前,紫花苜蓿耐濕性的研究報道較少,關于紫花苜蓿耐濕機理的研究比較缺乏。本研究以耐旱能力很強的我國新疆維吾爾自治區的地方品種新疆紫泥泉作為參照,以抗氧化酶和無氧呼吸酶活性變化為切入點,分析紫花苜蓿南方育成品種渝苜1號對淹水脅迫的耐受性及其生理響應機制,為紫花苜蓿耐濕性的后續研究及解決紫花苜蓿在南方的推廣利用提供一定的理論參考。
1.1 試驗材料
以在南方濕熱地區(重慶)育成的紫花苜蓿品種渝苜1號(Yumu No.1)和北方干旱地區地方品種新疆紫泥泉(Xinjiangziniquan)為試驗材料。渝苜1號種子是西南大學動物科技學院牧草研究室委托在新疆庫爾勒繁育的種子,新疆紫泥泉種子由甘肅農業大學草業學院曹致中老師提供。
1.2 試驗設計與淹水處理
試驗在西南大學牧草實驗室的玻璃溫室內進行。種子經消毒、催芽后,于露白時播于直徑為16 cm的裝有河沙的聚乙烯花盆中,每個花盆定苗10株,放入溫室培養。從真葉開始長出時,每3 d澆灌1次1/2 Hoagland營養液,中間澆1次清水。待幼苗長出4片真葉時進行淹水處理,將花盆放入40 cm×30 cm×30 cm的裝滿自來水的玻璃缸內,保持水面高于河沙表面1 cm。未進行淹水處理的為對照。1個花盆1個重復,試驗重復3次。
處理0,2,4,6,8,10 d時,分別取各個處理的葉片和根系進行酶活性的測定;并于處理10 d時測定植株的生物量。
1.3 測定項目與測定方法
1.3.1 鮮重、根冠比的測定 淹水10 d后,將生物量測定的材料,用水輕輕沖洗花盆中的河沙,將幼苗從花盆中完整取出并洗凈,用濾紙吸干表面的水分后用天平稱取花盆中所有植株的鮮重,然后將植株的地上和地下部分分開并稱重,計算根冠比及相對抑制率。
根冠比=植株根系鮮重(g)/植株地上部分鮮重(g)
相對抑制率=(1-處理組/對照組)×100%
1.3.2 MDA含量的測定 用TCA-TBA法[13]。取新鮮葉片0.2 g置于研缽中,加5%(W/V)三氯乙酸(TCA) 5 mL研磨,研磨后12000 r/min離心10 min,取上清液2 mL,加入用10%TCA配制成的0.67%(W/V)2-硫代巴比妥酸(TBA)溶液2 mL,混合液100℃水浴煮沸30 min后在冰上迅速冷卻,冷卻后12000 r/min離心10 min,取上清液分別測定其在450,532和600 nm處的吸光值。MDA濃度(C,μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450。式中,C為MDA濃度,A450、A532、A600分別代表450,532和600 nm波長下的吸光值。樣品MDA含量用nmol/g FW(鮮重)表示。MDA含量(nmol/g)=MDA濃度(C,μmol/L)×提取液總體積(0.005 L)×稀釋倍數(2)÷質量(0.2 g)×103。
1.3.3 SOD、POD和CAT活性的測定 參照Wang等[14]的方法提取酶液。分別稱取淹水處理和相應對照的葉片0.3 g放于研缽中,加入1.5 mL蛋白提取液[內含100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.5)、1 mmol/L EDTA和1%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮],在冰上將葉片研磨成勻漿,又在4℃,12000 r/min離心20 min,上清液即是粗酶液,取上清液轉入1.5 mL EP管中,用于酶活性的測定。SOD活性測定用NBT法[13], 以抑制氮藍四唑(NBT)光還原50%為1個酶活性單位(U)。POD活性測定用愈創木酚法[13],以OD470每min增加0.1為1個酶活性單位(U)。CAT活性測定參照Yang等[15]的方法, 以OD240每min減少0.1為1個酶活性單位(U)。每個酶活性測定重復3次,酶活性以U/g FW(鮮重)表示。
1.3.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)和乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)活性的測定 參照Mustroph和Albrecht[10]的方法提取酶液。分別稱取淹水處理和相應對照的根0.5 g于研缽中,加入1.5 mL預冷的提取液(內含50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、5 mmol/L β-巰基乙醇、15%甘油、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA和0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟,pH 6.8),冰浴研磨成勻漿,4℃,12000 r/min離心20 min,上清液即是粗酶液,取上清液轉入1.5 mL EP管中,用于酶活性的測定。乳酸脫氫酶(LDH)活性測定參照Wang等[16]的方法,乙醇脫氫酶(ADH)和丙酮酸脫羧酶(PDC)活性測定參照Li等[17]的方法,蛋白質含量測定參照Bradford[18]的考馬斯亮蘭G250法。以OD340每min底物減少1 μmol為1個酶活性單位(U),酶活性以U/g蛋白表示。
1.4 統計分析
采用SPSS 13.0,Duncan多重比較法進行統計分析,Excel作圖。
2.1 淹水脅迫對紫花苜蓿幼苗生長的影響
對淹水脅迫第10天的幼苗生物量測定結果表明,2個苜蓿品種的鮮重、根冠比均顯著低于對照(表1)。渝苜1號生長受抑制程度明顯低于新疆紫泥泉。淹水脅迫下,渝苜1號植株的鮮重和根冠比為對照的68.7%和53.4%,而新疆紫泥泉僅為對照的62.7%和44.1%;淹水對渝苜1號鮮重和根冠比的相對抑制率分別為31.2%和46.6%,明顯低于新疆紫泥泉的37.2%和56.0%(表1),表明淹水對渝苜1號的影響較新疆紫泥泉小,渝苜1號比新疆紫泥泉具有更強的淹水耐受性。

表1 淹水第10天對紫花苜蓿幼苗生長量的影響
表中數據表示平均值±標準差,不同大寫字母表示同一品種對照和處理間差異顯著(P<0.05),同列不同小寫字母表示同一測定項目不同品種間差異顯著(P<0.05)。
The data in the Table were expressed as Mean±SD, different capital letter means significant difference at 0.05 level between control and waterlogging test in the same vatiety, different small letters in a line mean significant differences at 0.05 level between different varieties under the same test.
2.2 淹水脅迫對葉片MDA含量的影響

圖1 淹水對紫花苜蓿幼苗葉片MDA含量的影響Fig.1 Effect of waterlogging on MDA content in the leaves of alfalfa seedlingsT:淹水Waterlogging;CK:對照Control; *和**:分別表示淹水條件下兩個品種間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同。*and**mean the significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same below.
淹水脅迫下葉片MDA含量如圖1所示。在整個試驗階段,對照植株中的MDA含量變化不大。淹水條件下,植株的MDA含量顯著增加,且新疆紫泥泉的MDA含量一直高于渝苜1號。從圖1還可以看出,新疆紫泥泉葉片MDA含量在第6天達到最大值,為對照的3.3倍,是渝苜1號的1.6倍,隨后開始下降,但淹水第10天仍顯著高于渝苜1號(P<0.05)。整個淹水階段渝苜1號MDA含量增加較新疆紫泥泉少,說明渝苜1號受淹水脅迫的影響較小,受到的傷害也比較小。
2.3 淹水脅迫對葉片中SOD、POD和CAT活性的影響
試驗過程中,對照植株的抗氧化酶活性變化不大,一直在小范圍波動,而淹水處理植株的酶活性變化比較大。淹水情況下,兩個品種SOD活性在淹水第2天稍微下降之后開始明顯增加,并在淹水第6天達到最大值,其中渝苜1號為544.5 U/g FW,新疆紫泥泉為406.8 U/g FW,二者差異顯著(P<0.01)。隨后,兩個品種SOD活性都迅速降低,在第10天降到對照水平以下,但渝苜1號仍高于新疆紫泥泉(圖2)。
兩個品種POD活性在淹水后開始增加,并在第4天達到最大值,隨后新疆紫泥泉中的POD活性開始迅速下降,而渝苜1號中的POD活性下降速度較慢,在淹水第8天渝苜1號中的POD活性是新疆紫泥泉的1.4倍,差異極顯著(P<0.01)(圖2)。
淹水處理后,兩個品種CAT活性明顯增強,在淹水第2天渝苜1號的CAT活性迅速達到峰值,是對照的2.3倍,是新疆紫泥泉的1.5倍。新疆紫泥泉的CAT活性在第4天達到最大值,隨后降低,而渝苜1號在淹水第6天依然保持著較高的CAT活性。在整個淹水處理過程中,渝苜1號的CAT活性明顯高于新疆紫泥泉(圖2)。
2.4 淹水脅迫對根系ADH、LDH和PDC活性的影響
整個淹水脅迫階段,兩個品種ADH活性都呈先增加后減小的趨勢,且都在第6天達到峰值,隨后,兩個品種ADH活性都降低。在淹水第8天,渝苜1號ADH活性是新疆紫泥泉的2.3倍,二者差異極顯著(P<0.01)。第10天,渝苜1號仍高于新疆紫泥泉(圖3)。
淹水處理后兩個品種植株中LDH活性都增加。淹水脅迫第2天,渝苜1號中的LDH活性達到最大值(5 U/g),是對照的1.7倍,但與新疆紫泥泉(4.4 U/g)差異不顯著。隨后,渝苜1號中的LDH活性一直在較小的范圍內波動,緩慢下降,而新疆紫泥泉中的LDH活性顯著增加,在第6天達到峰值(9.4 U/g),是對照的3.9倍,是渝苜1號的2.1倍,隨后新疆紫泥泉中的LDH活性顯著降低(圖3)。
兩個品種淹水脅迫后PDC活性增加,其中新疆紫泥泉的PDC活性在第2天達到最大值,隨后下降。而渝苜1號在淹水第6天才達到峰值,是新疆紫泥泉的1.5倍,兩者差異極顯著(P<0.01),隨后渝苜1號PDC活性也降低,總體來看,渝苜1號PDC活性比新疆紫泥泉高,持續時間長(圖3)。
本研究結果表明,淹水脅迫顯著抑制了紫花苜蓿的生長,但渝苜1號比新疆紫泥泉具有更強的淹水耐受性(表1)。渝苜1號是在南方濕熱地區(重慶)育成的品種,而新疆紫泥泉則是北方干旱地區的地方品種。許多研究表明品種育成地氣候與品種特性密切相關[19-21]。在濕熱地區育成的品種渝苜1號應表現出更具耐濕性。

圖2 淹水脅迫對紫花苜蓿幼苗葉片SOD、POD和CAT活性的影響Fig.2 Effect of waterlogging on the activity of SOD, POD and CAT in the leaves of alfalfa seedlings

圖3 淹水脅迫對紫花苜蓿幼苗根系ADH、LDH和PDC活性的影響Fig.3 Effect of waterlogging on the activity of ADH, LDH and PDC in the leaves of alfalfa seedlings
土壤淹水時,缺氧是最主要的脅迫因素。缺氧時,植物根系依靠氧的反應過程被抑制,ATP供不應求,植物通過啟動無氧呼吸,進入發酵代謝,依靠NAD+氧化底物生成ATP(底物水平磷酸化)來維持植物的生長發育[22]。LDH是植物缺氧進行乳酸發酵不可缺少的一種酶。旱生植物淹水之后缺氧誘導LDH活性迅速升高,淹水很短的時間之后就以乳酸發酵為主,這是不耐低氧植物的顯著特征[23]。PDC與ADH是植物缺氧進行乙醇發酵不可缺少的酶,抗淹水植物的淹水耐性與ADH活性的變化呈正比,在淹水條件下,ADH活性迅速升高,將有毒物質乙醛轉化成乙醇,幫助植物躲避缺氧根系的主要毒害物質之一乙醛的傷害[8]。在擬南芥中發現PDC是乙醇發酵的限速酶,過量表達丙酮酸脫羧酶基因pdc1和pdc2的擬南芥植株在淹水條件下的成活率明顯增加[24]。可見淹水之后以乙醇發酵為主,是耐低氧植物的顯著特征。本研究的兩個品種在淹水2 d以后各個階段,渝苜1號根系無氧呼吸酶ADH和PDC的活性均高于新疆紫泥泉,而LDH的活性則低于新疆紫泥泉(圖3),說明在淹水條件下渝苜1號NAD+產生的主要途徑不是乳酸發酵而是乙醇發酵。因此,乙醇發酵是渝苜1號耐缺氧的一種戰略,是渝苜1號比新疆紫泥泉耐水淹的重要理由之一。
淹水脅迫下,植物體內氧化代謝紊亂,產生過多的活性氧類物質(ROS),產生氧化脅迫,但植物體內的抗氧化酶保護系統能夠清除自由基的損傷,保護植物免受氧化傷害[25-26]。研究表明,SOD、POD和CAT活性高能夠保護植物在長時間水淹時免受活性氧的傷害,對維持植物存活具有重要意義[7-8]。淹水條件下,渝苜1號比新疆紫泥泉能夠維持更高的SOD、POD和CAT活性水平(圖2),這就使它能夠更好地消除活性氧,保護植株免受更嚴重的氧化傷害,這也是說明渝苜1號比新疆紫泥泉更耐淹水脅迫的理由之一。
淹水脅迫下,紫花苜蓿生長受到嚴重抑制,抑制幅度與品種耐濕強弱有關。在濕熱地區育成的品種渝苜1號耐淹水能力比新疆紫泥泉強,因為渝苜1號抗氧化酶活性更高,而且在缺氧條件下主要通過乙醇發酵途徑,具有耐低氧植物特征。
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Effect of waterlogging on antioxidant and anaerobic respiratory enzymesinMedicagosativavarieties from southern and northern China
QUAN Rui-Lan1,2, YU Yong-Xiong1*
1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 2.XinyangCityAcademyofAgriculturalSciences,Xinyang464000,China
TwoMedicagosativavarieties, Yumu No.1 (southern China) and Xinjiangziniquan (northern China), were compared. Six waterlogging treatments; 0, 2, 4, 6, 8 and 10 days of waterlogging were imposed on seedlings at the 4-leaf stage. The malondialdehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) activity in the leaves and lactate dehydrogenase (LDH), pyruvate (PDC) and alcohol dehydrogenase (ADH) activity in the roots were evaluated in all treatments. Biomass was measured after 10 days of waterlogging. Waterlogging stress reduced the biomass of both varieties but Yumu No.1 was less affected than Xinjiangziniquan. The activities of SOD, POD and CAT in leaves of Yumu No.1 were higher than those of Xinjiangziniquan under waterlogging stress, but the MDA content in the leaves was lower than that of Xinjiangziniquan. The activity of respiratory enzymes in the roots was influenced by waterlogging; In Yumu No.1 ADH and PDC activity increased more than LDH activity with stronger alcohol dehydrogenaseactivity, while in Xinjiangziniquanwaterlogging resulted in increased LDH and lactic dehydrogenase activity. It was concluded that the greater tolerance of waterlogging observed in Yumu No.1 was primarily due to higher antioxidant enzyme and anaerobic respiratory enzyme activity.
waterlogging stress;Medicagosativa; variety; antioxidant enzyme; anaerobic respiratory enzyme
10.11686/cyxb20150510
http://cyxb.lzu.edu.cn
2014-03-11;改回日期:2014-11-03
973計劃課題(2007CB108901),948項目(2014-Z31)和國家“十一五”支撐計劃項目(2011BAD36B02,2011BAD36B03)資助。
全瑞蘭(1985-),女,河南平頂山人,碩士。E-mail:qrlhe@163.com *通訊作者Corresponding author. E-mail:yuyongxiong8@126.com
全瑞蘭, 玉永雄. 淹水對紫花苜蓿南北方品種抗氧化酶和無氧呼吸酶的影響. 草業學報, 2015, 24(5): 84-90.
Quan R L, Yu Y X. Effect of waterlogging on antioxidant and anaerobic respiratory enzymesinMedicagosativavarieties from southern and northern China. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(5): 84-90.