滲透壓及彈性增強結合蛋白在椎間盤退變中作用的研究進展

·綜述·

滲透壓及彈性增強結合蛋白在椎間盤退變中作用的研究進展

林文波，曹鵬，楊晨，袁文

作者單位：200003上海，第二軍醫大學長征醫院骨科

通信作者：袁文yuanwenspine@gmail.com

【關鍵詞】椎間盤退行性變; 彈性蛋白; 轉錄因子; 滲透壓

基金項目：上海市科委國際合作項目(13430721000)

作者簡介：林文波(1990— )，碩士，醫師

【中圖分類號】R 341.31【文獻標志碼】 A

DOI【】

收稿日期：(2014-10-14)

隨著中國人口的老齡化，頸椎病、腰椎椎間盤突出癥等脊柱退行性相關疾病的發生率日趨升高，給人民群眾造成了巨大的健康威脅和經濟負擔[1]。椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是導致脊柱退行性相關疾病的主要病理基礎，其發生機制較為復雜，至今尚無明確定論。IDD病理特點主要包括：髓核細胞數量減少和功能下降，細胞外基質成分改變，如蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等大分子的合成減少，降解增加，滲透壓下降，炎癥細胞入侵等。在眾多病理生理因素的綜合作用下，椎間盤組織吸收、緩沖應力的能力下降[2]，發生纖維環變性破裂，椎間高度丟失，最終喪失生物學功能，導致椎間盤突出、脊柱不穩、神經根和脊髓病變及相應臨床癥狀和體征[3]。

研究顯示高滲透壓具有促進髓核細胞外基質合成以及維持細胞功能及表型的作用[4]，而髓核細胞可以通過轉錄因子彈性增強結合蛋白(Tonicity Enhancer Binding Protein，TonEBP)系統調節細胞外基質合成，維持細胞內外的滲透壓平衡。本文擬對椎間盤組織內高滲透壓環境的生理學特點及其對髓核細胞的作用，以及TonEBP系統在細胞內環境穩態調節中的作用作一綜述。

1髓核組織高滲透壓微環境的生理特點

脊柱是人體的主要承載結構，其中椎間盤發揮著重要作用。當人體處于不同的活動狀態時，椎間盤內的靜水壓也隨之發生變化。椎間盤組織主要通過提高髓核組織的滲透壓和調節髓核細胞外基質的水合狀態來承受巨大的壓縮應力[5]。因此，凝膠狀的髓核組織就如同一個可以隨時調節氣壓大小的氣墊，發揮著緩沖作用。髓核細胞的細胞外基質由聚蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等大分子構成。聚蛋白聚糖的組成成分包括250 kDa的核心蛋白、糖胺聚糖、硫酸軟骨素以及硫酸角質素等，是髓核細胞外基質的主要成分[6]。聚蛋白聚糖的降解導致髓核組織吸附水的能力下降，進而引起椎間盤調節生物應力的能力下降并逐漸導致椎間高度丟失。

1.1髓核組織的滲透壓形成機制

髓核組織細胞外基質中的聚蛋白聚糖分子上有大量帶負電荷的糖氨聚糖側鏈，這些側鏈可與鈉離子、鉀離子等結合，從而形成髓核組織細胞外基質的高滲透壓[7]。高滲透壓使得髓核組織在高應力作用下仍能保持對水分子的吸附力。van Dijk等[8]研究顯示,椎間盤內的滲透壓值為430～496 mOsm/kg·H2O(1 mOsm/kg·H2O≈25.6667 kPa)不等。

1.2髓核組織的水合狀態及滲透壓調節

髓核組織中的含水量大約為77%，Wang等[9]曾用固液雙相混合物來形容髓核組織的解剖形態。水分子在髓核組織中有結合型和游離型2種存在形式:結合型水分子反映聚蛋白聚糖以及膠原蛋白的電荷分布，游離型水分子的多少取決于組織的滲透壓和靜水壓[10]。髓核組織的水合狀態并非恒定不變，而是隨著應力的變化而時刻改變的。椎間盤所受到的應力主要來自體重和肌肉活動，晚間休息時應力最低，為0.1～0.2 MPa；白天活動狀態下椎間盤內壓力最高可達3 MPa。在高應力作用下，髓核組織中的水就被擠出；到晚間應力下降時，又重新與聚蛋白聚糖結合。因此，細胞外基質的滲透壓也就隨著晝夜活動的變化而發生相應的改變[11]。

2高滲透壓促進髓核組織細胞外基質的合成

Wuertz等[7]將人和牛髓核細胞分別在滲透壓為300 mOsm/kg，400 mOsm/kg和500 mOsm/kg的培養基中進行離體培養，隨著培養基滲透壓的升高，髓核細胞聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達量逐漸上升，而Ⅰ型膠原的表達量則受到抑制。他們認為，高滲透壓具有促進細胞外基質合成的作用，滲透壓的降低可能是加快椎間盤退變進程的重要因素之一。Neidlinger-Wilke等[12]研究顯示將培養基滲透壓從300 mOsm/kg提高到500 mOsm/kg能增加聚蛋白聚糖的表達，而基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3, MMP-3)mRNA的表達量下降。MMP-3是髓核組織細胞外基質降解的主要酶類，是重要的基質金屬蛋白酶之一，與椎間盤退變之間存在密切關系，能夠降解蛋白多糖、層黏連蛋白、纖維連接蛋白等多種細胞外基質成分[13]。MMP-3還可激活其他潛在的各類MMPs，形成瀑布效應，加速椎間盤退變的進程[14]。

Spillekom等[15]研究髓核細胞在不同滲透壓培養基中brachyury蛋白、聚蛋白聚糖以及糖胺聚糖的表達情況，結果表明當滲透壓為400 mOsm/Kg時，brachyury蛋白、聚蛋白聚糖以及糖胺聚糖的表達量最高。其中Brachyury蛋白是髓核細胞的分子表型標記物之一[16]。

雖然各研究機構在髓核細胞體外培養的最適滲透壓上沒有達成統一，但是可以明確的是在一定范圍內，高滲透壓具有促進髓核細胞外基質合成和維持髓核細胞功能及表型的作用。

3髓核細胞通過轉錄因子TonEBP系統維持細胞內外的滲透壓平衡

內環境穩態對于髓核細胞維持正常結構和生理功能非常重要，滲透壓的改變可導致細胞內蛋白質和核酸的結構、功能發生改變，繼而誘發細胞自噬、衰老甚至凋亡[17]。研究發現，細胞內環境滲透壓改變后，髓核細胞發生了一系列適應性改變以防止其對細胞結構和功能產生損害[10]。近年來TonEBP在髓核組織滲透壓調節中的作用受到關注。TonEBP又稱為T細胞活化核因子5(nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5)，是哺乳動物體內唯一已知的能由高滲透壓激活的轉錄因子。TonEBP在髓核細胞調節滲透壓的過程中發揮著重要作用[17]。

3.1髓核細胞通過TonEBP維持滲透壓平衡

Tsai等[18]研究表明TonEBP在椎間盤髓核和纖維環組織中均有表達，且表達量較高。TonEBP激活后通過與目的基因的彈性反應增強子序列結合，促進目的基因的表達，從而調節滲透壓，維持細胞內環境穩態。TonEBP的目的基因包括醛糖還原酶、γ-氨基丁酸轉運蛋白、鈉離子-肌醇轉運蛋白以及牛磺酸轉運蛋白等，TonEBP激活后可調節山梨醇、內銨鹽、肌醇和牛磺酸等有機滲透溶質的跨膜轉運，進而調節細胞胞漿的滲透壓。TonEBP介導的滲透壓調節與經典的滲透壓調節方式(通過鈉離子轉運蛋白調節無機電解質離子的跨膜轉運速率)相比，其優勢在于：通過調節有機滲透溶質的跨膜轉運，可實現在調節滲透壓的同時不改變細胞膜電位，不影響細胞內各種酶和核酸等生物大分子的理化性質和功能結構。此外，該研究團隊進一步研究發現，沉默TonEBP的表達后，髓核細胞在高滲環境中的細胞活力和增殖能力下降[19]。這一研究證明了高滲透壓環境下，轉錄因子TonEBP在髓核細胞的生存和增殖過程中的確發揮著重要作用。

Gajghate 等[20]研究發現，在髓核細胞的細胞膜上有水通道蛋白-2(Aquaporin-2,AQP2)表達。AQP2是滲透壓敏感的水通道蛋白，主要受精氨酸加壓素調節，在腎臟集合管重吸收水的過程中發揮著重要作用。在髓核組織中，滲透壓改變可通過激活TonEBP調控細胞膜上水通道蛋白AQP2的表達，調節水分子的跨膜轉運和細胞外基質的水合狀態，繼而調節髓核細胞內外的滲透壓平衡[21]。

3.2髓核細胞通過TonEBP調節細胞外基質的合成

除了維持髓核細胞內外滲透壓平衡外，TonEBP在促進髓核細胞外基質的合成中也發揮著重要作用。

Tsai等[18]研究發現，聚蛋白聚糖的啟動子序列中存在可與TonEBP結合的TonE共有序列。通過顯性失活或者RNA干擾技術抑制TonEBP的表達后，聚蛋白聚糖的啟動子活性顯著降低，證明在髓核細胞中，TonEBP可以在轉錄水平調節細胞外基質的合成。

Hiyama等[22]研究發現，TonEBP可以調節β1,3-葡聚糖醛基轉移酶-1(1,3-glucuronosyltransferase-1，GlcAT-1)的表達。該酶是糖氨聚糖合成的限速酶。糖氨聚糖是聚蛋白聚糖的主要結構，與核心蛋白及透明質酸結合后水化形成超分子結構，這一超分子結構所形成的流體力學調節系統在調節椎間盤的生物應力中發揮著重要作用。Hiyama等[23]進一步研究發現髓核細胞中骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)促進葡聚糖醛基轉移酶的表達也是通過TonEBP介導的。

Mak等[24]報道成功構建2種TonEBP基因敲除的小鼠模型。然而，該模型目前存在圍生期死亡率高等問題，這很大程度上限制了其在科學研究中的廣泛運用。Wiig等[25]報道成功構建的TonEBPfl/fl 小鼠在一定程度上促進對TonEBP在椎間盤組織中調控機制的深入研究。

因此，筆者認為髓核組織中的高滲透壓相關轉錄因子TonEBP能促進細胞外基質合成，維持細胞內外滲透壓平衡，調節椎間盤生物應力，對髓核組織內環境穩態和生物學功能的維持具有重要意義。因此，可以認為是椎間盤退變的保護因素。

高滲透壓是髓核細胞內環境的重要理化性質之一，在髓核細胞外基質的合成、細胞表型和功能的維持中發揮著重要作用。高滲透壓相關轉錄因子TonEBP在髓核細胞中具有促進細胞外機制合成，維持內環境穩態等重要作用。因此，對髓核組織高滲透壓微環境及轉錄因子TonEBP調控機制的進一步研究，將有利于闡明椎間盤退變的病理生理機制，并為脊柱退行性相關疾病的生物治療提供新的方向和思路。

參 考 文 獻

[1] Martin BI, Deyo RA, Mirza SK, et al. Expenditures and health status among adults with back and neck problems[J]. JAMA, 2008, 299(6):656-664.

[2] 陳國仙.椎間盤退變機制研究進展[J].脊柱外科雜志, 2006, 4(3);174-178.

[3] Le Maitre CL, Pockert A, Buttle DJ, et al.Matrix synthesis and degradation in human intervertebral disc degeneration[J]. Biochem Soc Trans, 2007, 35(Pt 4):652-655.

[4] Ishihara H, Warensjo K, Roberts S, et al. Proteoglycan synthesis in the intervertebral disk nucleus: the role of extracellular osmolality[J]. Am J Physiol, 1997, 272(5 Pt 1):C 1499-1506.

[5] Cabraja M, Endres M, Abbushi A , et al. Effect of degeneration on gene expression of chondrogenic and inflammatory marker genes of intervertebral disc cells: a preliminary study Effect of degeneration on gene expression of chondrogenic and inflammatory marker genes of intervertebral disc cells: a preliminary study[J]. J Neurosurg Sci, 2013, 57 (4):307-316.

[6] Aspberg A. The different roles of aggrecan interaction domains[J]. T J Histochem Cytochem, 2012, 60 (12):987-996.

[7] Wuertz K, Urban JPG, Klasen J, et al. Influence of extracellular osmolarity and mechanical stimulation on gene expression of intervertebral disc cells[J]. J Orthop Res, 2007, 25(11):1513-1522.

[8] van Dijk B, Potier E, Ito K. Culturing bovine nucleus pulposus explants by balancing medium osmolarity[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2011, 17 (11):1089-1096.

[9] Wang Q, Yang YY, Niu HJ, et al. An ultrasound study of altered hydration behaviour of proteoglycan-degraded articular cartilage[J]. BMC Musculoskelet Disord, 2013, 14:289.

[10]Johnson ZI, Shapiro IM, Risbud MV. Extracellular osmolarity regulates matrix homeostasis in the intervertebral disc and articular cartilage: Evolving role of TonEBP[J]. Matrix Biol, 2014, 40C:10-16.

[11]Wilke HJ, Neef P, Caimi M, et al. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life[J]. Spine (Phila Pa 1976), 1999, 24 (8):755-762.

[12]Neidlinger-Wilke C, Mietsch A, Rinkler C, et al. Interactions of environmental conditions and mechanical loads have influence on matrix turnover by nucleus pulposus cells[J]. J Orthop Res, 2012, 30 (1):112-121.

[13]Wang X, Wang H, Yang H, et al. Tumor necrosis factor-alpha- and interleukin-1beta-dependent matrix metalloproteinase-3 expression in nucleus pulposus cells requires cooperative signaling via syndecan 4 and mitogen-activated protein kinase-NF-kappaB axis: implications in inflammatory disc disease[J]. Am J Pathol, 2014, 184(9):2560-2572.

[14]袁宇飛，彭寶淦. 腰椎椎間盤退變過程中炎癥介質作用的研究進展[J].脊柱外科雜志,2012，10(5):310-314

[15]Spillekom S, Smolders LA, Grinwis GC, et al. Increased Osmolarity and Cell Clustering Preserve Canine Notochordal Cell Phenotype in Culture[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2014, 20 (8):652-662.

[16]Risbud MV, Shapiro IM. Notochordal cells in the adult intervertebral disc: new perspective on an old question[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2011, 21 (1):29-41.

[17]Cheung CY, Ko BC. NFAT5 in cellular adaptation to hypertonic stress-regulations and functional significance[J]. J Mol Signal, 2013, 8(1):5.

[18]Tsai TT, Danielson KG, Guttapalli A, et al. TonEBP/OREBP is a regulator of nucleus pulposus cell function and survival in the intervertebral disc[J]. J Biol Chem, 2006, 281 (35):25416-25424.

[19]Tsai TT, Guttapalli A, Agrawal A,e t al. MEK/ERK signaling controls osmoregulation of nucleus pulposus cells of the intervertebral disc by transactivation of TonEBP/OREBP[J]. J Bone Miner Res, 2007, 22 (7):965-974.

[20]Verkman AS. Roles of aquaporins in kidney revealed by transgenic mice[J]. Seminars in nephrology, 2006, 26:200-208.

[21]Gajghate S, Hiyama A, Shah M, et al. Osmolarity and intracellular calcium regulate aquaporin2 expression through TonEBP in nucleus pulposus cells of the intervertebral disc[J]. J Bone Miner Res, 2009, 24 (6):992-1001.

[22]Hiyama A, Gajghate S, Sakai D, et al. Activation of TonEBP by calcium controls {beta}1,3-glucuronosyltransferase-I expression, a key regulator of glycosaminoglycan synthesis in cells of the intervertebral disc[J]. J Biol Chem, 2009, 284 (15):9824-9834.

[23]Hiyama A, Gogate SS, Gajghate S, et al. BMP-2 and TGF-beta stimulate expression of beta1,3-glucuronosyl transferase 1 (GlcAT-1) in nucleus pulposus cells through AP1, TonEBP, and Sp1: role of MAPKs[J]. J Bone Miner Res, 2010, 25 (5):1179-1190.

[24]Mak MC, Lam KM, Chan PK, et al. Embryonic Lethality in Mice Lacking the Nuclear Factor of Activated T Cells 5 Protein Due to Impaired Cardiac Development and Function[J]. PLoS One, 2011, 6(7):e19186.

(本文編輯于倩)