長鏈非編碼RNA ANRIL的研究進展

江 澈，王偉民

(廣州軍區廣州總醫院 腦病中心，廣東 廣州510000)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是多細胞動物基因組的一個重要特征，包括長200～1 000 000bp 由DNA 轉錄而來但不編碼蛋白的RNA。高通量轉錄組分析發現人類基因組中存在大量lncRNA，廣泛參與機體的發育、分化、代謝等生理病理過程。ANRIL(antisense non coding RNA in the INK4 locus)是人Chr9p21 上CDKN2A/B 基因叢轉錄的長鏈非編碼RNA，主要定位于細胞核。該基因區域與人類的一些疾病相關，既往的研究提示ANRIL 在介導Chr9p21位點的功能中發揮重要作用。

1 人類ANRIL的序列和進化特征

在對黑色素細胞瘤-神經系統腫瘤家族的遺傳研究中，人們首次發現在人類全血白細胞和類淋巴母細胞系內存在一段位于INK4位點的反義非編碼RNA，并將其命名為ANRIL(GenBank accession No.DQ485453)[1]。ANRIL 也 被 稱 為CDKN2BAS 等。ANRIL 起源于胎盤哺乳動物，在哺乳動物進化過程中獲得了額外的外顯子，隨后在嚙齒類動物的進化中丟失了一部分，最終在猿類中完全形成，并變得高度保守[2]。編碼ANRIL 基因的序列位于Chr9p21.3位點，其長度為126.3 kb。該基因可在與CDKN2A/B 基因叢相反的方向上選擇性轉錄20個外顯子，mRNA 全長3 834 bp[3]。很多外顯子僅包含LINE、SINE 和Alu 重復元件。ANRIL的內含子1 包含p15/CDKN2B的外顯子1 和2，其5'末端的外顯子1位于p14/ARF 基因轉錄起始位點上游～300 bp 處。ANRIL 由RNA 聚合酶II 轉錄，可被剪接形成至少20種線性轉錄子或環形轉錄子，這些剪接變異子具有組織特異性[3-4]。在小鼠體內存在一段70 kb的基因序列，與人Chr9p21 上58 kb的冠心病危險區域同源[5]，其缺失導致CDKN2A/B表達的嚴重下調。這段70 kb的序列包含一段反義非編碼RNA，但與人ANRIL 無同源性。

2 ANRIL的表達和調控

2.1 調控ANRIL表達的上游通路

一些9p21 上的SNPs 破壞了STAT1 等轉錄因子結合位點[6-7]，提示該位點的表達受到多種信號通路調控。該位點的SNPs 同時也能改變ANRIL的結構和基因表達[4，8-12]，并影響ANRIL 對多種疾病的易感性。ANRIL的調控具有細胞型特異性。促炎因子INF-γ 激活轉錄因子STAT1，誘導內皮細胞ANRIL的表達，但抑制類淋巴母細胞ANRIL的表達[7]。在ANRIL 和ARF的基因間區域的CpG 島存在CCCTC 結合因子(CTCF)結合位點，CTCF 結合后保護DNA 不被甲基化，維持CDKN2A/B位點的穩定[13]。DNA 損傷刺激中，轉錄因子E2F1 能以ATM依賴的方式上調ANRIL的表達，參與細胞DNA 修復[14]。此外，ANRIL 也受到microRNA的調控[15]。

2.2 ANIRL的下游通路

ANRIL的外顯子與其他功能性非編碼RNAs 一樣表達水平較低。較早發現的線性轉錄子有長鏈的NR_003529 以及短鏈的DQ485454 和EU741058。二代測序的研究結果表明ANRIL 不同外顯子的含量存在差異[4]。ANRIL的功能不依賴于完整的轉錄子，存在的“莖環”等特殊結構能被多梳(Polycomb)蛋白識別并結合，包含這些結構的轉錄子即能成為獨立的調控分子[16]。ANRIL的中央外顯子(4至12號外顯子)[4]形成環形同工型，其表達與心血管疾病危險等位基因相關。

多梳蛋白是一組參與轉錄基因抑制的蛋白，具有多梳抑制性復合物1 和2(PRC1 和PRC2)兩種多蛋白復合物形式。PRC2 通過催化K27H3的甲基化參與基因沉默的啟動，PRC1 通過單泛素化組蛋白H2A 參與靶基因沉默的維持。這些機制在細胞分化、細胞身份維持和腫瘤發生中發揮重要作用。ANRIL 能特異結合CBX7(PRC1 亞基)和SUZ12(PRC2 亞基)并調控CDKN2A/B位點的組蛋白修飾，啟動并維持CDKN2A/B位點的沉默[17]。Dicer是RNA干擾機制的關鍵組分，負責siRNA 和miRNA的產生。ANRIL 也能以Dicer 蛋白依賴途徑[18]沉默CDKN2B。ANRIL 也有除CDKN2A/B 外的其他作用靶點，參與細胞增殖、凋亡、衰老、細胞外基質和炎性應答等[6]。

3 ANRIL的功能以及在疾病中的表達

3.1 ANRIL 在腫瘤中的作用

ANRIL 與CDKN2A/B 基因座抑制相關。CDKN2A/B 基因座位于人類9號染色體p21 上，這段區域包括3個重要的腫瘤抑制基因:CDKN2A、CDKN2B和MTAP。其中CDKN2A 通過選擇性閱讀框編碼2個不同的蛋白，P16和ARF。該區域在30%～40%的人類腫瘤中發生改變。全基因組關聯研究(GWAS)表明ANRIL是神經膠質瘤、白血病、黑色素細胞瘤、基底細胞癌、鼻咽癌和乳腺癌等腫瘤的危險位點[17]。此外，ANRIL 還與前列腺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌等腫瘤相關[15]。CDKN2A/B位點在年輕的健康細胞中被沉默，衰老和致癌因素能刺激其表達。該位點升高的表達與一些老化組織的再生潛能損害有關。CDKN2A/B 在人類腫瘤中被廣泛沉默，提示其在抑制腫瘤發生中起關鍵作用。ANRIL 通過直接結合CDKN2B 轉錄子并募集PRC來抑制CDKN2A/B 基因座上的基因。在體內和體外實驗條件，ANRIL的缺失或沉默與增殖降低相關[11]。降低的增殖可能是提前衰老的結果，這是一個重要的預防腫瘤發生的機制。最近的研究表明，ANRIL的表達在非小細胞肺癌組織中上調，并與腫瘤-淋巴結轉移階段和腫瘤大小顯著相關[19]。與這些研究相反，在多發性神經纖維瘤患者，9p21.3位點的rs2151280-T 等位基因與ANRIL的表達降低和叢狀纖維神經瘤數量增多相關[20]。此外，黑色素細胞瘤相關變異子rs1011970-T 也與ANRIL表達的降低相關[9]。由于ANRIL的多種外顯子具有組織特異性，而既往研究針對的是不同的外顯子區域，使得對相關性的解釋較復雜。

3.2 ANRIL 在心血管疾病中的作用

ANRIL是9p21位點內引起動脈粥樣硬化性血管疾病的首要候選基因，雖然其起促進或抑制的作用尚存爭議[9-10]。GWAS 研究發現ANRIL 基因是冠心病和腹主動脈瘤等動脈粥樣硬化性疾病的遺傳易感位點[21]。后續研究證實了ANRIL 與這些疾病的聯系[8]，9p21區域內與缺血性腦卒中和冠心病相關的SNPs位于ANRIL 基因[10]。一個大樣本研究分析了4個9p21區域的心血管疾病相關SNPs，發現冠心病危險單倍型引起某些ANRIL 剪接子(EU741058 和NR_003529)表達升高，后者與動脈粥樣硬化的程度一致[12]。亞洲印度人群的研究表明，9p21.3 冠心病危險間隔的5個遺傳變異位點的CGGGG 單倍型具有較高的發病風險，而GAAAA 單倍型則具有預防冠心病的作用。其中，rs2383206 與冠心病具有最強的關聯，GG 基因型與ANRIL 轉錄子EU741058表達升高和p16表達降低相關[22]。一項對中國漢族人群腦卒中的隨機對照研究發現，rs10757278 和rs10757274的GG 基因型與腦卒中(包括動脈粥樣硬化血栓形成、腔隙性梗死和腦出血，排除了栓塞性卒中和蛛網膜下腔出血)風險升高和復發有關。Rs10757278的GG 基因型與AA 基因型相比，MTAP、ANRIL 短轉錄子DQ485454 和EU741058 在粥樣硬化斑塊內的表達顯著降低，而p16INK4a 和ANRIL 長轉錄子NR_003529表達升高[23]。此外，幾個小樣本的研究發現冠心病和腦卒中的危險等位基因與ANRIL 降低的表達相關[8-9，11]。另有研究表明，ANRIL的5個相關SNPs與冠狀動脈微血管功能有關[24]。ANRIL 可能參與動脈粥樣硬化中的血栓形成、血管壁重建和修復和斑塊穩定機制。ANRIL 可能通過調控CARD8 進而增加缺血性腦卒中的風險[6]。Alu元件是靈長類基因組特有的含量豐富的短散在重復序列，ANRIL 能通過轉錄子上的Alu 模體標記靶基因的啟動子從而反式調控，引發動脈粥樣硬化的相關機制[3]。

動物研究方面，人們建立了染色體4qC4/5位點70 ku 缺失的重組小鼠系，該區域與人9p21.3 上的58 ku 非編碼間隔同源，包含ANRIL的3'末端(Δ58:外顯子13-19)[5]。Chr4Δ70 kb/Δ70 kb小鼠的原代主動脈SMCs表現出過度的增殖和減弱的老化，該過程能促進冠心病的發生。小鼠體內的CDKN2A 有促進動脈粥樣硬化的作用，而MTAP 具有保護作用。MTAP-ANRIL 融合轉錄子在動脈粥樣硬化中的作用需要進一步研究。

此外，ANRIL 也與非粥樣硬化性血管病如顱內動脈瘤相關[25]。ANRL的這些與心血管疾病的關聯是獨立于大多數傳統危險因素的，可能是一個新的病因[10]。

3.3 ANRIL 在其他疾病中的作用

GWAS表明ANRIL是2型糖尿病的遺傳易感位點，9p21區域糖尿病相關危險變異子(rs10811661-T 和rs2383208-A)與ANRIL表達的下調相關[9]。此外，一些研究表明ANRIL的表達與牙周炎、骨髓纖維化、阿爾茨海默病、青光眼和子宮內膜異位等多種疾病相關。

4 問題和展望

非編碼RNA 能通過多種機制介導基因表達調控。關于短鏈非編RNAs 如microRNAs的研究已有大量報道。近年來，長鏈非編碼RNAs 逐漸被發現是基因表達的重要調控子。其中，Chr9p21.3位點的長鏈非編碼RNA ANRIL 在介導多種疾病中發揮重要作用。

雖然ANRIL 參與多種組織特異性表觀調控機制，但它的很多功能無法用現有的機制解釋。存在幾個主要問題:第一，ANRIL 參與眾多病因不相關的疾病的發生和發展，也參與移動/黏附、增殖和死亡/凋亡等細胞過程，ANRI 通過怎樣的機制參與這些疾病，這些疾病又存在何種潛在關聯有待進一步研究;第二，ANRIL 具有多種線性和環形同工型，發揮不同的生理作用，它們的作用方式、相互之間的聯系不清楚，既往的研究通過檢測少數幾個外顯子測定某種同工型的含量，可能混雜了其他同工型，今后的研究需更加特異、全面地測定并區分所有同工型;第三，ANRIL 擁有大量下游靶點，不僅調控臨近的CDKN2A/B 基因，也有獨立于CDKN2A/B的通路機制，其他通路需要進一步的研究來揭示。此外，由于ANRIL 在嚙齒類動物中不存在同源性，只能用人體細胞進行離體實驗，為研究帶來不便。

ANRIL是在不同水平和細胞類型中介導人類疾病的關鍵調控分子，目前它已經成為一些腫瘤和動脈粥樣硬化的生物標記，其水平的高低反應疾病的嚴重程度。隨著研究的進展，ANRIL的作用機制將被進一步揭示，未來有望成為治療人類疾病的新靶點。

[1]Pasmant E，Laurendeau I，Héron D，et al.Characterization of a germ-line deletion，including the entire INK4/ARF locus，in a melanoma-neural system tumor family:identification of ANRIL，an antisense noncoding RNA whose expression coclusters with ARF[J]Cancer Res，2007，67:3963-3969.

[2]He S，Gu W，Li Y，et al.ANRIL/CDKN2B-AS shows twostage clade-specific evolution and becomes conserved after transposon insertions in simians [J].BMC Evol Biol，2013，13:247.doi:10.1186/1471-2148-13-247.

[3]Holdt LM，Hoffmnn S，Sass K，et al.Alu elements in ANRIL non-coding RNA at chromosome 9p21 modulate atherogenic cell functions through trans-regulation of gene networks[J].PLoS Genet，2013，9:e1003588.doi:10.1371/journal.pgen.1003588.

[4]Burd CE，Jeck WR，Liu Y，et al.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk[J].PLoS Genetics， 2010， 6: e1001233.doi: 10.1371/journal.pgen.1001233.

[5]Visel A，Zhu Y，May D，et al.Targeted deletion of the 9p21 non-coding coronary artery disease risk interval in mice[J].Nature，2010，464:409-412.

[6]Bai Y，Nie S，Jiang G，et al.Regulation of CARD8 expression by ANRIL and association of CARD8 single nucleotide polymorphism rs2043211 (p.C10X)with ischemic stroke[J].Stroke，2014，45:383-388.

[7]Harismendy O，Notani D，Song X，et al.9p21 DNA variants associated with coronary artery disease impair interferon-γ signalling response [J].Nature，2011，470:264-268.

[8]Liu Y，Sanoff HK，Cho H，et al.INK4/ARF transcript expression is associated with chromosome 9p21 variants linked to atherosclerosis[J].PLoS One，2009，4(4):e5027.doi:10.1371/journal.pone.0005027.

[9]Cunnington MS，Santibanez KM，Mayosi BM，et al.Chromosome 9p21 SNPs associated with multiple disease phenotypes correlate with ANRIL expression[J].PLoS Genet，2010， 6 (4 ): e1000899.doi: 10.1371/journal.pgen.1000899.

[10]Broadbent HM，Peden JF，Lorkowski S，et al.Susceptibility to coronary artery disease and diabetes is encoded by distinct，tightly linked SNPs in the ANRIL locus on chromosome 9p[J].Human Mol Genet，2007，17:806-814.

[11]Congrains A，Kamide K，Oguro R，et al.Genetic variants at the 9p21 locus contribute to atherosclerosis through modulation of ANRIL and CDKN2A/B[J]Atherosclerosis，2012，220:449-455.

[12]Holdt LM，Beutner F，Scholz M，et al.ANRIL expression is associated with atherosclerosis risk at chromosome 9p21[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30:620-627.

[13]Wan G，Mathur R，Hu X，et al.Long non-coding RNA ANRIL (CDKN2B-AS)is induced by the ATM-E2F1 signaling pathway [J].Cell Signalling， 2013， 25:1086-1095.

[14]Zhang EB，Kong R，Yin DD，et al.Long noncoding RNA ANRIL indicates a poor prognosis of gastric cancer and promotes tumor growth by epigenetically silencing of miR-99a/miR-449a[J].Oncotarget，2014，5:2276-2292.

[15]Guil S，Soler M，Portela A，et al.Intronic RNAs mediate EZH2 regulation of epigenetic targets[J].Nat Struct Mol Biol，2012，19:664-670.

[16]Bei J，Li Y，Jia WH，et al.A genome-wide association study of nasopharyngeal carcinoma identifies three new susceptibility loci[J].Nat Genet，2010，42:599-603.

[17]Yu W，Gius D，Onyango P，et al.Epigenetic silencing of tumour suppressor gene p15 by its antisense RNA [J].Nature，2008，451:202-206.

[18]Nie FQ，Sun M，Yang JS，et al.Long noncoding RNA ANRIL promotes non-small cell lung cancer cell proliferation and inhibits apoptosis by silencing KLF2 and P21 expression[J].Mol Cancer Ther，2015，14:268-277.

[19]Pasmant E，Sabbagh A，Masliah-Planchon J，et al.Role of noncoding RNA ANRIL in genesis of plexiform neurofibromas in neurofibromatosis type 1 [J].J Natl Cancer Inst，2011，103:1713-1722.

[20]Rodriguez C，Borgel J，Court F，et al.CTCF is a DNA methylation-sensitive positive regulator of the INK/ARF locus[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，392:129-134.

[21]Helgadottir A，Thorleifsson G，Magnusson KP，et al.The same sequence variant on 9p21 associates with myocardial infarction，abdominal aortic aneurysm and intracranial aneurysm[J].Nat Genet，2008，40:217-224.

[22]Shanker J，Arvind P，Jambunathan S，et al.Genetic analysis of the 9p21.3 CAD risk locus in Asian Indians[J].Thromb Haemost，2014，111:960-969.

[23]Zhang W，Chen Y，Liu P，et al.Variants on chromosome 9p21.3 correlated with ANRIL expression contribute to stroke risk and recurrence in a large prospective stroke population[J].Stroke，2011，43:14-21.

[24]Yoshino S，Cilluffo R，Best PJM，et al.Single nucleotide polymorphisms associated with abnormal coronary microvascular function[J].Coron Artery Dis，2014，25:281-289.

[25]Yasuno K，Bilguvaar K，Bjlnga P，et al.Genome-wide association study of intracranial aneurysm identifies three new risk loci[J].Nat Genet，2010，42:420-425.